05),但25μmol/L～200μmol.LNaHS能提高PC12细胞的存活率(P0.05)；③多奈哌齐能降低Aβ25-35引起的细胞毒性作用,提高PC12细胞存活率(P0.05)；②不同浓度NaHS和多奈哌齐均可降低Aβ40, Aβ42和sAPPβ蛋白表达水平,还可增高sAPPα蛋白表达水平,这种作用与H2S浓度有相关性。结论：外源性H2S和多奈哌齐可以诱导APP/Aβ代谢途径向非淀粉样途径(α途径)转变,H2S的这种作用具有浓度依赖性。 AG-014699 价格 第三部分外源性硫化氢和多奈哌齐对PC12细胞α分泌酶(ADAM10/ADAM17)的影响 目的：观察H2S和多奈哌齐对PC12细胞α-分泌酶ADAM10和ADAM10蛋白的影响,探讨二者对APP代谢途径的转变作用是否与ADAM10和ADAM17相关。方法：以PC12细胞为研究对象,用NaHS作外源性H2S供体,实验设空白对照组、NaHS10、25、50、100和200μmol/L组、多奈哌齐20μmol/L组,共7组。按分组浓度分别处理PC12细胞24h后,用Western

blot检测代谢过程中关键蛋白ADAM10和ADAM17的表达水平。结果：不同浓度NaHS和多奈哌齐组的ADAM10和ADAM17蛋白表达水平较对照组增高,且随着NaHS浓度增加,蛋白表达水平呈递增趋势(P0.05),但100μmol/LNaHS组的ADAM10及ADAM17蛋白表达水平最高(P0.05),而SP组、LY组ADAM10和ADAM17的蛋白表达降低。②SB组Aβ40、Aβ42、sAPPβ和sAPPα蛋白表达与对照组比较无显著变化(P>0.05)。LY组、SP组Aβ40、Aβ42和sAPPβ蛋白表达显著增强,并降低sAPPα蛋白的表达,与对照组比较具有显著差异性(P<0.01)。③SP组、LY组H2S增强ADAM10蛋白表达的作用降低,H2S降低Aβ40、Aβ42和sAPPβ蛋白表达的作用减弱,与对照组比较具有显著差异(P<0.01)；SB组、SP组、LY组多奈哌齐增强ADAM10、ADAM17蛋白表达的作用均降低,多奈哌齐降低Aβ40、Aβ42和sAPPβ蛋白表达的作用减弱,与对照组比较具有显著差异(P<0.01)。④SP组、LY组可抑制H2S升高sAPPα蛋白的表达,与对照组比较具有显著差异(P<0.01)；SB组、SP组、LY组可抑制多奈哌齐升高sAPPα蛋白的表达,与对照组比较具有显著差异(P
从中草药、植物中寻找有效且毒副反应小的抗肿瘤药物俨然已成为新世纪国内外学者研发抗癌药物的新方向。香芹酚已证实具有多方面的药理作用，且对人的正常细胞毒性较小。已有多项实验研究表明香芹酚能抑制多种肿瘤细胞的生长，但对人肝细胞肝癌的抑制作用及其机制尚未见报道。

这个 PLX4032细胞系 目的： 研究香芹酚对肝癌HepG-2细胞增殖及凋亡的影响，并初步探讨其可能的分子机制。 方法： 体外培养肝癌HepG-2细胞及肝细胞LO-2，分别以不同浓度的香芹酚作用24h，MTT法检测香芹酚的的抗增殖效应，Hoechst33258染色法及流式细胞术分析香芹酚诱导肝癌HepG-2细胞凋亡作用，Western Blot法分析香芹酚对肝癌HepG-2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3及PARP表达的影响以及MAPK家族蛋白的各种磷酸化形式。最后，分别使用P38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580阻断P38MAPK信号通路和ERK/MAPK信号通路特异性阻断剂U0216阻断ERKMAPK信号，通过MTT法及Hoechst33258染色法检测其阻断后肝癌HepG-2细胞的增殖及凋亡变化。 结果： 香芹酚对人肝癌HepG-2细胞的抗增殖效应表现出剂量依赖性，随着香芹酚浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，香芹酚对肝癌HepG-2细胞24h作用时的IC50浓度为0.32mM，而同样条件下香芹酚对肝细胞LO-2细胞表现出低毒性。Hoechst33258核染色及流式细胞术的结果显示香芹酚诱导了肝癌HepG-2细胞的凋亡，Hoechst33258核染色的结果显示随着香芹酚浓度的增加(0、0.05、0.1、0.2、0.4mM)，HepG-2细胞呈现出明显的凋亡形态改变；流式细胞仪检测的细胞凋亡比率明显升高，随着浓度的升高其凋亡率依次为：3.70±0.22%、13.50±1.59%、25.80±2.18%、30.50±0.25%、50.60±3.81%。Western

Blot结果发现香芹酚处理肝癌HepG-2细胞24h后，Bcl-2蛋白的表达明显减弱，且呈浓度依赖性；当香芹酚浓度在0.2mM以上时出现caspase-3的激活及cleaved PARP片断，亦呈浓度依赖性，说明香芹酚诱导肝癌HepG-2细胞凋亡与线粒体途径相关。予以相同浓度的香芹酚处理肝癌HepG-2细胞15min后，Western Blot结果发现磷酸化ERKMAPK蛋白的表达逐渐下降；磷酸化P38MAPK亦被激活，但其蛋白表达随浓度变化无明显趋势；而JNK磷酸化未被激活。在阻断ERKMAPK信号转导通路后，香芹酚对肝癌HepG-2细胞抗增殖效应增强而诱导凋亡效应无变化；阻断p38MAPK信号转导通路后，香芹酚对肝癌HepG-2细胞诱导凋亡作用减弱，同时抗增殖效应减弱。 结论： 1.香芹酚具有以剂量依赖性方式抗肝癌HepG-2细胞的效应； 2.抗肝癌HepG-2细胞的效应是通过抑制增殖及诱导凋亡； 3.

In conclusion, Tet can impede the migration and invasion of RA-FLS, which provides 因为 a plausible explanation for its protective effect on RA. The underlying mechanisms involve the reduction of the expressions of Rac1, Cdc42, and Rho A, inhibition of the activation of Akt and JNK, and subsequent down-regulation of activation and/or expressions of MMP-2/9, F-actin, and FAK.
睡眠是一种自发的和可逆的静息状态,表现为机体对外界刺激的反应性降低和意识的暂时中断。作为一种自适应的、保护性活动,睡眠是个体恢复体力的一种重要途径。然而,新近的研究发现,睡眠不仅对恢复体力,而且对恢复脑力也具有重要的意义。良好的睡眠不仅是后续学习和记忆的重要保障,而且有助于记忆的巩固和保持。有关睡眠与学习记忆的相关研究不仅改变了传统的睡眠观,而且对教育教学具有重要的启示。
背景:颌面部骨缺损以及牙周组织缺损是影响人类功能和美观的重要疾病之一,组织工程骨成为了修复颌面部骨和牙周组织缺损的主要手段。目前已形成了种子细胞及细胞共培养、支架材料、微环境三者复合以构建组织工程骨的基本模式,将组织工程骨进行预血管化并促进其快速成骨可以减少植入物的坏死、吸收,提升骨缺损修复的成功概率。目的:归纳总结近5年内组织工程骨在口腔颌面部及牙周组织上的研究新进展。方法:对CNKI数据库和Pub

Med数据库2010年至2015年文献进行检索,中文检索关键词为:颌面;组织工程骨;骨再生;血管化;基因修饰;种子细胞;支架材料;微环境,英文检索词为:oral and maxillofacial,bone tissue engineering,bone regeneration,vascularization,Genetic modification,Seed cells,Support material,Micro environment。排除无关性研究、重复性研究,保留68篇中英文文献进行归纳总结。结果与结论:组织工程骨在修复口腔颌面部及牙周缺损上的应用得到了巨大发展,在三维结构的支架材料上加载基因修饰的种子细胞可以有效的促进血管化进程,提高成骨效应,增加颌骨缺损修复术的成功概率。此外,在牙槽嵴缺损处或新鲜拔牙窝处植入组织工程骨材料,可以有效的恢复和保存牙槽嵴高度和宽度,为后续的修复治疗保证了良好的骨条件。在植入组织工程骨后,可在缺损处加载不同的外部环境刺激,可以通过调节细胞外基质成分或信号通路来改变血管化进程,而血管化是建立有效血循环,保证植入支架成功的前提条件。
目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)对体外培养人肺组织细胞因子IL-17A/F表达的影响及机制。方法从部分肺组织切除手术中获得10例无慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的实质性肺组织,在无菌条件下切成1 时间 mm厚的组织块,并在不同浓度的CSE(0%、2.5%、5%和10%)中培养3 h或6 h。通过检测培养上清液中乳酸脱氢酶水平对组织存活力进行评估。利用Western blot蛋白印迹和实时定量PCR方法检测肺组织中IL-17A/F的表达水平。通过应用MAPK p38、ERK1/2、NF-κB和PI3K信号通路的抑制剂来观察作用机制。结果培养3h或6

h后,不同浓度的CSE培养的肺组织无明显损伤。在蛋白表达水平上,3 h后5%的CSE使肺组织中IL-17的表达明显升高(P<0.05),同时IL-17的mRNA表达水平也明显升高(P
p38MAPK信号通路是细胞内外主要的信息传递途径之一,可通过调节细胞增殖、分化、凋亡等生理病理过程,影响多种细胞内应答。近年研究发现,通过三级酶促级联反应激活p38MAPK信号转导通路,磷酸化下作用于下游转录因子NF-κB、AP-1等调节特定的基因表达,可影响细胞的存活状态,导致炎症介质的产生,引起一系列生物学效应,从而促进肾脏的纤维化,在多种肾脏疾病的发生发展中起着很重要的作用。本文主要将p38MAPK与急性肾损伤、糖尿病肾脏病、狼疮性肾炎、多囊肾、终末期肾脏病等疾病的病情发生发展情况做一综述,阐明其与相关肾脏疾病关系的作用机制,以及对该通路的干涉在临床治疗上的应用,可能存在的问题及其未来发展趋势。
目的探讨白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板的ROS产生和PECAM-1表达的影响以及相关的分子机制。方法用ox-LDL刺激血小板,应用Western LDN-193189分子重量 blot检测PECAM-1、Sirt1的表达以及p38MAPK的磷酸化。用荧光试剂盒检测ROS水平。结果 1 ox-LDL刺激血小板时聚集率为14%,100μmol·L~(-1)白藜芦醇抑制了血小板聚集,抑制率为50%。2白藜芦醇减少了ox-LDL诱导的ROS产生约3.

5mmol/L，HG组给予D-glucose30mmol/L，为了控制高渗透压对细胞实验结果的影响，MG组应用24.5mol/L甘露醇+D-glucose5.5mmol/L作为对照。各组细胞同步培养48小时后收集，应用western blot和real-time PCR方法检测gremlin1蛋白和mRNA在高糖环境足细胞中的表达；应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1在足细胞中的分布情况及定位特点。 2重组gremlin1对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响 应用重组的小鼠gremlin1细胞因子与高糖共同刺激足细胞，模仿生物体内高糖环境下gremlin1过表达的情形。①首先探讨gremlin1对高糖环境足细胞发生作用的最佳浓度和时间，即量效和时效关系实验。用高糖分别混合0、0.1、0.25、0.5、0.75、1μg/ml的gremlin1培养分化成熟的足细胞48小时，应用western blot和real-timePCR方法，找出gremlin1对足细胞nephrin和synaptopodin负性调控最明显的浓度作为下一步应用gremlin1的浓度依据。其次应用高糖混合最佳作用浓度的gremlin1因子分别培养成熟足细胞0、6、12、24、48、72小时，找出gremlin1对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin负性调控作用的最佳时间。②在最佳gremlin1作用浓度(0.75μg/ml)和时间(48h)条件下，分别设置正常对照（NC）、高糖对照(HG)和高糖+gremlin1(HG+grem1)对照，应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1对足细胞nephrin和synaptopodin表达和定位的影响，直观分析gremlin1对足细胞的损伤作用。③设置对照如上，应用TUNEL检测gremlin1对足细胞凋亡的影响。计数TUNEL阳性细胞数。④应用western、real-time

Procaspase activation GDC-0199制造商 PCR方法检测Bcl-2、Bax、Cleaved Casepase-3等凋亡相关蛋白表达，以弥补TUNEL方法缺陷，与TUNEL一起共同评价gremlin1对高糖足细胞凋亡的影响。 3Gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响 分化成熟的足细胞分为高糖组(HG)、高糖+gremlin1-siRNA组(HG+grem.siRNA)和高糖+对照siRNA组(HG+con.siRNA)。①优化转染条件，找出化学合成的gremlin1-siRNA沉默gremlin1基因表达的最佳剂量。②应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin表达及定位的影响，评价gremlin-siRNA对足细胞的影响。③应用western blot和real time PCR的方法观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin表达的影响。④应用TUNEL方法观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞凋亡的影响，并计数TUNEL阳性细胞。⑤检测gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞Bcl-2、Bax和Cleaved DNA Damage抑制剂 Caspase-3等凋亡相关蛋白表达的影响，进一步印证gremlin1-siRNA对足细胞凋亡的影响。 4介导gremlin1对高糖环境足细胞损伤的信号机制研究 ①由于在DN肾组织上发现TGF-β1和gremlin1表达共定位，因此我们研究高糖环境时二者之间是否存在特定关系。将分化成熟的高糖培养的足细胞分为两组，一组高糖培养基中加入重组的gremlin1细胞因子（0.75μg/ml）共同孵育48小时，检测TGF-β1的蛋白和mRNA表达情况（HG+grem1组）；另一组采用高糖培养基中加入重组的TGF-β1细胞因子（5ng/ml）共同孵育48小时，检测gremlin1的蛋白和mRNA表达情况（HG+TGF-β1组）；另外设置正常对照组（NC）和高糖对照组(HG)分别检测gremlin1和TGF-β1的表达。②与gremlin1相关的TGF-β信号分子的检测：用高糖与重组gremlin1（0.75μg/ml）共同孵育足细胞0、15、30、60、120、240分钟后，检测smad2/3、p-smad2/3、p38、p-p38、JNK1/2、p-JNK1/2等经典与非经典TGF-β信号分子，找出与gremlin1具有时效关系的信号途径进行阻断实验研究，以期发现其中的调控机制。③上述实验结果发现TGF-β/smad2/3信号途径与gremlin1作用相关。应用TGF-β1受体阻断剂SB431542阻断TGF-β1信号，观察TGF-β1受体阻断后对gremlin1抑制的nephrin和synaptopodin蛋白表达的影响。④应用smad2/3-siRNA转染高糖和gremlin1共同培养的小鼠足细胞，48小时后收获细胞，验证smad2/3敲减效果，并检测smad2/3敲减后对gremlin1抑制的nephrin和synaptopodin蛋白表达的影响。

结果： 1Gremlin1在高糖环境足细胞中的表达与分布 ①足细胞F-actin免疫荧光染色结果显示，在33℃，γ-IFN存在的许可条件下培养，足细胞呈梭形或三角形，细胞突起较少。在37℃，无-IFN的非许可条件下培养10-14天后，足细胞胞体上伸出大量足突，胞浆向四周展开，呈树枝状。Synaptopodin免疫荧光染色结果显示，未分化足细胞胞浆中synaptopodin的表达几乎没有，而分化10天后的足细胞中synaptopodin的表达明显增强，提示足细胞已分化成熟。②Western blot结果：在正常对照及甘露醇对照组，gremlin1蛋白表达很少，而HG组gremlin1表达明显上调(p<0.

05);缺血再灌注组再灌注后24 h可见Bcl-2表达减少,但与空白对照组及假手术组相比无统计学差异(P>0.05),而再灌注后24 h可见Bax蛋白表达明显增加,与空白对照组及假手术组相比有统计学差异(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达明显增加(P
目的探讨前炎介质肽聚糖(peptidoglycan,PGN)对BV2细胞内吞β淀粉样蛋白1-42(amyloid proteinβ,Aβ1-42)寡聚体的影响及其机制。方法采用细胞株传代法培养BV2细胞,分别替代小胶质细胞;按Klein

WL(2002)方法制备Aβ1-42寡聚体;采用免疫荧光染色鉴定BV2细胞内吞Aβ的量;Western blotting方法检测各组BV2细胞磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、p38MAPK蛋白表达情况;PCR方法检测各组BV2细胞鼠同系物甲酰肽受体(mouse homologue formyl peptide receptor 2,mFPR2)mRNA。结果 PGN激活BV2细胞内吞Aβ1-42寡聚体增多,可被mFPR2拮抗剂抑制;PGN可引起BV2细胞表达mFPR2 mRNA增多,且存在浓度、时间相关性,可被SB202190-p38MAPK抑制剂抑制,且随着SB202190浓度增加,抑制程度增加,各组浓度与0μmol/L相比,抑制明显差异有统计学意义,1μmol/L组P<0.01;PGN作用BV2细胞后各时间点p38MAPK的磷酸化激活程度同对照组相比差异有统计学意义(P
内皮细胞激活是内皮细胞损伤的始动因素,是引起各种不同程度的炎症反应和细胞凋亡的前提条件 哪里 ;丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 还有 是哺乳动物细胞中重要的信号转导通路,其中 p38MAPK 通路在细胞应激、细胞生长、凋亡和炎症等多种生理和病理过程中起重要作用,越来越引起业界的广泛关注,本文就 p38MAPK 信号通路及其与内皮细胞激活的相关性做一综述,旨在进一步对内皮细胞损伤引发心血管疾病研究提供参考资料。
肝纤维化是多种慢性肝病发展演变为肝硬化的必经阶段,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的活化与增殖是肝纤维化发生的关键环节,目前与HSC有关的信号转导机制是普遍的研究焦点.干预HSC的研究主要有:干扰细胞信号转导通路,抑制炎症反应,对抗氧化应激,调节相关细胞因子活性等.本文综述了P38

MAPK信号通路的主要功能、常见研究方法及对肝纤维的作用机制,以期为实验研究提供思路.

目的:探讨血管内皮生长因子_(165)(VEGF_(165))对人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)内游离镁离子浓度([Mg~(2+)]_i)的调节机制。方法:采用荧光指示剂mag-fura-2及运用PTi阳离子测定系统动态检测HUVECs的[Mg~(2+)]_i。结果:经酪氨酸激酶阻断剂(tryrphostin A23和genistein),磷脂酰3激酶阻断剂(wortmannin和LY294002),磷脂酶Cγ阻断剂(U73122)预处理,均显著阻断VEGF_(165)诱导的[Mg~(2+)]_i增加。但经磷脂酶C阻断剂无活性的类似物(U73343)和增殖激活蛋白激酶阻断剂(SB202190和PD98059)预处理,不能阻断VEGF_(165)诱导的[Mg~(2+)]_i增加。结论:VEGF_(165)通过酪氨酸激酶/磷脂酰3激酶/磷脂酶Cγ信号转导途径使细胞内的Mg~(2+)库释和Mg~(2+),从而增加HUVECs的[Mg~(2+)]_i。
为了探讨人单核细胞中,人单核细胞趋化因子1(monocyte chemoattractant 点击此处 protein-1,MCP-1)诱导信号转导激活转录因子3(signal transducers and activators of transcription 3,Stat3)磷酸化以及导致磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated

protein kinase,MAPK)信号通路途径在其中的作用,首先采用针对Stat3 705位酪氨酸和727位丝氨酸特异性抗体进行磷酸化时间和剂量的检测,发现MCP-1仅导致Stat3丝氨酸磷酸化并且呈剂量和时间依赖性,而酪氨酸并没有磷酸化.在此基础上,采用不同时间点的方法对MAPK途径成员细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38、JNK进行检测,发现MCP-1在人单核细胞中仅诱导ERK、p38活化并呈时间依赖性,而不能诱导激活JNK途径.为了确证ERK、p38途径在人单核细胞中参与MCP-1诱导的Stat3丝氨酸磷酸化,采用ERK、p38途径活化的小分子抑制化合物不同浓度处理单核细胞,对Stat3丝氨酸磷酸化检测发现,MCP-1通过ERK、p38两条途径参与Stat3丝氨酸磷酸化.这些结果表明,MCP-1在人单核细胞中仅诱导Stat3丝氨酸磷酸化而不是酪氨酸磷酸化;MAPK成员中ERK、p38两条途径均参与MCP-1诱导的Stat3丝氨酸磷酸化,而JNK途径没有活化参与Stat3丝氨酸磷酸化.
目的研究离体肝脏缺血再灌注早期丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,p38MAPK)信号转导途径对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA和细胞间黏附分子-1(inter-cellular adhesion molecule1,ICAM1)mRNA表达的影响。方法建立兔离体肝脏缺血再灌注模型,对照组(n=12):灌注液中不加特异性p38MAPK抑制剂SB202190;抑制组(n=12):灌注液中加入SB202190(浓度3μmol/L)。分别于肝脏离体前,冷保存末,再灌注10、30、60及120min时获取肝组织标本。分别应用Western blot法及免疫沉淀法检测肝组织中p38MAPK蛋白的表达及活性;RT-PCR法检测肝组织中TNF-α mRNA的表达水平,原位杂交法检测肝组织中ICAM1 mRNA的表达水平。结果2组动物肝组织中p38MAPK蛋白的表达水平各时相均无明显改变(P>0.05),且2组间其表达水平的差异也无统计学意义(P>0.

01)；且DM组低于CN组(P<0.01)。DMCI组的DM病程长于DM组,差别有统计学意义(P<0.05)。(2)三组患者IMT的差别有统计学意义(P<0.01),组间比较差别有统计学意义(P<0.01)。三组患者颈动脉粥样硬化斑块的检出率及不同性质斑块的检出率的差别有统计学意义(P<0.01)。斑块发生部位多见于颈总动脉近分叉处(61.3%),其次为颈内动脉起始处(20.5%),且易发生在双侧。(3)DMCI组的颈动脉斑块检出率显著高于CN组(P0.05)；其不稳定斑块检出率明显升高,与DM组、CN组的差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)；多元线性回归分析表明TC、HbA1c、VEGF与EPCs的数量独立相关(P<0.01)。(5)DMCI组的外周血EPCs水平显著低于其它两组,且不稳定斑块患者EPCs水平低于稳定斑块患者,差异有统计学意义(P0.05)。(6)

DMCI组的外周血MMP-9水平显著高于其它两组,且不稳定斑块患者MMP-9水平高于稳定斑块患者,差异有统计学意义(P
目的：糖尿病神经病变(diabetic neuropathy,DN)是糖尿病常见的慢性并发症之一,随着糖尿病(diabetes mellitus, DM)发病率的增高,DN对健康的危害性日益明显。目前,对DN的预防和治疗主要以控制血糖和对症治疗为主,但疗效欠佳。因此对其病因及其发病机制的深入研究将有助于我们有效地干预DN的发生和发展。我们在临床工作中,对部分2型糖尿病患者进行的皮肤活检、肾活检和骨骼肌活检发现,以上器官有多种免疫复合物沉积,提示免疫因素参与了DM及其慢性并发症的发病过程。在随后完成的系列研究中,我们发现在链脲佐菌素(STZ)诱导的DM大鼠的脊髓、背根神经节和坐骨神经均存在免疫和炎症反应的激活,应用环孢菌素A(CsA)可明显延缓病变,保护组织。 TSA HADC临床试验 吡格列酮是噻唑烷二酮类药物(Thiazolidinediones, 获悉更多 TZDs),目前作为胰岛素增敏剂广泛应用于临床。近年来的研究发现,TZDs药物还具有免疫调节和抗炎作用。本实验拟进一步研究STZ诱导的DM大鼠模型脊髓和腓神经的病理改变、发病机制以及吡格列酮的干预作用,为DN的临床治疗提供新的思路。 方法：96只雄性SD大鼠,随机抽取12只大鼠作为正常对照组(CON组),其余84只以静脉注射STZ的方法制造DM大鼠模型。所有成模大鼠根据血糖水平分层后,随机分为PIO小剂量治疗组(PioL组,4mg/kg/d)、PIO大剂量治疗组(PioH组,20mg/kg/d)、PIO联合甘精胰岛素治疗组(PiI组,PIO4mg/kg/d+甘精胰岛素4U//kg/dXCsA治疗组(CsA组,1mg/kg/d\CsA联合甘精胰岛素治疗组(CsI组CsAlmg/kg/d+甘精胰岛素4U//kg/d)、甘精胰岛素治疗组(Ins组,4U//kg/d)、DM未治疗组(DM组)。PIO配置成混悬液后予以灌胃,CsA溶于橄榄油后予以皮下注射,甘精胰岛素予以皮下注射。成模16周后处死。留取血、尿标本分别检测肝肾功能、血糖和胰岛素水平。HE染色光镜下观察各组大鼠脊髓和腓神经的组织学病理改变,通过免疫组化和免疫荧光方法检测上述器官IgG、IgA和IgM的沉积。采用免疫组化方法观察炎症因子TNFα及其信号转导通路NF-κB和p-p38MAPK蛋白在各组大鼠脊髓和腓神经的表达情况。

结果：1.STZ以45mg/kg的剂量静脉注射后,检测大鼠血糖大于16.7mmol/l,确定造模成功。2.造模16周后单用PIO或CSA干预组大鼠血糖较DM组血糖无统计学差异(p>0.05),表明其干预作用不依赖于血糖水平。3.各PIO和CSA干预组大鼠ALT、AST、TBIL水平与CON组比较无统计学差异(p>0.05),各PIO和CSA干预组大鼠血清ALB、BUN、Cr水平较DM组显著改善,有统计学差异(p<0.05)4.造模后16周,HE染色见DM各组大鼠脊髓无明显形态学改变；而腓神经出现轴突变细、髓鞘肿胀、神经血管周围淋巴细胞浸润的改变,各PIO和CSA干预组形态学损伤减轻,PioH组的损伤减轻程度接近CSA组。5.造模16周,DM组大鼠脊髓和腓神经可见IgG、IgA、IgM异常沉积,各PIO和CsA干预组大鼠脊髓和腓神经免疫球蛋白的沉积不同程度减少,以Csl组最明显,CSA组次之,PioH组改善情况接近CSA组,IOD值分析两组无统计学差异(p<0.05)。6.DM组大鼠脊髓和腓神经TNF-α、NF-κB和p-p38MAPK蛋白表达较CON组均明显增加,各PIO和CsA治疗组大鼠以上各项指标的组织表达水平不同程度降低,以CsI组最明显,CSA组次之,PioH组降低至接近CSA组水平,IOD值分析两组无统计学差异(p
目的：观察地佐辛和帕瑞昔布钠对切口痛大鼠行为、脊髓肿瘤坏死因子α

因为 (TNF-α)及血浆PGE-2表达的影响,探讨地佐辛和帕瑞昔布钠镇痛的可能作用机制,为临床联合使用地佐辛和帕瑞昔布钠进行术后镇痛提供依据。 方法：健康成年雄性Wistar大鼠32只,随机分为：对照组(DoPo组)、地佐辛组(D1Po组)、帕瑞昔布钠组(D0P1组)、联合地佐辛和帕瑞昔布钠组(D1P1组),每组8只。DoPo组做切口痛模型,尾静脉注射生理盐水；D1Po组在术毕随即尾静脉缓慢注射地佐辛5mg；D0P1组在术毕随即尾静脉缓慢注射帕瑞昔布钠10mg/kg; D1P1组在术毕随即尾静脉注射帕瑞昔布钠10mg/kg,地佐辛5mg。计数大鼠清醒后0-60min内12个时间段内的累计疼痛评分。大鼠清醒后2h腔静脉取血2m1,处死大鼠取脊髓膨大处,用ELISA试剂盒检测脊髓TNF-α和血浆PGE-2的含量。 结果： (1)与DoPo组比较：D1P0组,DoP1组,D1P1组大鼠累计疼痛评分下降(P<0.05)；与D1Po组比较：DoP1组疼痛评分升高(P<0.05),D1P1组评分小于D1P0(P<0.05)；与DoP1组比较：D1P1组大鼠累计疼痛评分下降(P0.05)；与D1Po组比较：DoP1组脊髓TNF-α表达增加(P0.05)；与DoP1组比较：D1P1组脊髓TNF-α表达下降(P<0.05)；与D1P0组比较：DoP1组,D1P1组血浆PGE-2水平均下降(P0.

05)。④Mev组较对照组相比Bax表达降低(P＜0.05)。Mev+SB203580组Bax表达较Mev组相比无明显影响。⑤Mev组较对照组相比Bcl-2表达增加(P＜0.05)。Mev+SB203580组与Mev组相比Bcl-2表达无明显影响。 结论在本实验条件下1.Mev能促进HMC的增殖,并呈现浓度依赖性和时间依赖性。2.Mev可使TGF-β表达增加,加入p38MAPK特异性阻断剂SB203580后TGF-β表达无明显下降。3.Mev诱导的通路下游Bax和Bcl-2的表达的变化与p38MAPK通路之间无明显相关。
背景百草枯是一种接触性的脱叶剂和除草剂,目前在世界范围内广泛使用。临床上经常遇到百草枯(paraquat,PQ)自服或误服的中毒患者。由于百草枯毒性强,且目前临床上针对百草枯中毒尚无有效的治疗手段,因此致死率极高。百草枯吸收进入人体之后可导致多脏器功能的损害,其中最严重的损害部位在肺,主要表现为早期的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)以及后来逐渐进展的肺纤维化。百草枯的具体中毒机制尚未完全阐明,因此进一步探讨百草枯的中毒机制和寻找新的治疗靶点迫在眉睫。百草枯进入人体后,可以被肺泡上皮细胞所吸收,引起肺组织内各类细胞的氧化应激反应,进而能够通过多种信号通路介导肺组织甚至全身产生大量炎症因子,尤其是上调肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等的表达,进一步加重了急性肺损伤反应,早期阻断或减轻肺组织的炎症反应过程与抑制后期的肺纤维化进展以及对改善患者的预后密切相关。与炎症反应密切相关的丝裂原活化蛋白酶(mitogen

寻找更多 activated kinas, MAPKs)家族中的p38MAPK一直成为各领域研究的热点和难点,大量研究证实p38MAPK在参与肺损伤的炎症反应和细胞凋亡等机制中发挥了重要的作用,p38MAPK通过调节基因水平或后转录水平的蛋白变化进而调节下游的炎症反应,增加TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达,而TNF-α和IL-1p作为炎症反应的关键因子可以反过来再激活p38MAPK,这样在炎症反应过程中就形成了一个恶性循环。然而目前p38MAPK与百草枯中毒所致ALI相关性的研究甚少。本研究旨在探讨p38MAPK介导的炎症反应与百草枯所致肺损伤之间的关系,并应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580干扰阻断,以进一步明确其在治疗中的潜在临床意义。目的探讨p38MAPK在百草枯所致急性肺损伤炎症反应中的作用,进一步明确急性百草枯中毒致肺损伤的机制,并用抑制剂干扰以期为临床治疗提供新的靶点。方法分别选取96只健康雄性SD大鼠,重量在250-300g,按照随机数字表法随机分为四组并按照以下剂量和方法给药：(1)生理盐水组(NS组),24只,生理盐水20mg/kg;(2)百草枯中毒组(PQ组),24只,PQ

20mg/kg;(3)PQ+抑制剂组(PQ+SB),24只,PQ20mg/kg+SB203580 10mg/kg;(4)抑制剂组(SB),24只,SB203580 10mg/kg。其中PQ中毒致大鼠急性肺损伤的模型采用本课题组前期制作的病理模型,即按照20mg/kg的剂量腹腔注射,PQ+SB组和SB组在PQ给药前提前半小时腹腔一次性注入抑制剂SB203580 10mg/kg。分别于实验开始后的第1、3、5、7d各取6只抽取腹主动脉血处死大鼠,取肺组织和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar 这个 lavage fluid,BALF)样本,分别检测肺干湿重、肺泡灌洗液和肺组织中的TNF-a和IL-1β,肺组织病理切片观察肺组织结构并进行病理评分,westemblot方法检测肺组织p38MAPK、p-p38MAPK的表达水平。结果1)各组大鼠湿干比(wet/dry,W/D)变化PQ与NS组相比,肺W/D值明显升高,且在3、5、7d三个时间点差异均有统计学意义(P<0.05);PQ+SB组的病理评分显著低于PQ组(P<0.05)。研究结果证实了PQ中毒后大鼠肺组织病理损伤明显加重,抑制剂SB203580干预后对PQ引起的肺组织有一定的保护作用。3)大鼠肺组织中TNF-α及IL-1β的含量变化Elisa结果显示PQ中毒组的大鼠肺组织和BALF中TNF-α、IL-1β表达水平明显高于NS组,且在各个时间点差异均有统计学意义(P0.05),其它在各个时间点PQ+SB组的大鼠肺组织和BALF中TNF-α、IL-1β的水平较PQ组均明显下降(P<0.05)。表明了PQ中毒后可引起大鼠肺组织中炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平的明显升高,用SB203580干预后可以降低炎症因子的表达水平。4)大鼠肺组织中p38MAPK、p-p38MAPK的表达量变化westernblot结果显示PQ组p-p38MAPK表达水平较NS组明显增多(P<0.05),PQ+SB组较PQ组表达水平有所下降(P<0.05),表明了PQ中毒后可以引起p-p38MAPK表达水平的明显增高,且用抑制剂SB203580干预可以降低p-p38MAPK的表达水平。p-p38MAPK在NS,SB,PQ,PQ+SB四个组中条带的平均灰度比值为1：0.8：5.3：3.4。结论1)p38MAPK参与了百草枯致大鼠急性肺损伤的炎症反应过程。2)p38MAPK的特异性抑制剂SB203580干预后抑制了p-p38MAPK的表达,减轻了其介导的炎症反应,从而减轻了PQ导致的急性肺损伤反应,为临床治疗PQ中毒提供了新的治疗靶点。
目的:研究乌司他丁对内毒素(LPS)诱导下的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的影响,探讨其治疗ARDS的可能作用机制,为乌司他丁的临床应用提供进一步理论基础与实验依据。方法:选用健康、雄性SD大鼠40只,随机分成5组:正常对照组:在SD大鼠尾静脉注射1ml生理盐水;LPS组:在SD大鼠尾静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS)5mg/Kg(使用前生理盐水稀释至1ml),复制ARDS模型;LPS+UTI组:造模方法同前,复制ARDS模型后立刻于腹腔左侧注射乌司他丁10万U/Kg(使用前生理盐水稀释至1ml);LPS+SB203580组:造模方法同前,复制ARDS模型后立刻于腹腔右侧注射p38

更多 MAPK阻断剂SB203580(5mg/Kg)(溶于0.1ml,10%二甲基亚砜DMSO,使用前用生理盐水稀释至1ml);LPS+UTI+SB203580联合组:造模方法同前,复制ARDS模型后立刻于腹腔左右侧分别注射乌司他丁和SB203580(剂量计算方法同前)。观察8h后,10%水合氯醛腹腔麻醉下开腹分离腹主动脉,抽取腹主动脉血测Pa O2,酶联免疫吸附试验(ELISA)测肺组织细胞因子TNF-ɑ的含量,蛋白印迹法(Western Blot)测肺组织p38 MAPK磷酸化蛋白表达程度,并行肺组织病理切片、电镜片对照分析。结果:1.

76%),并且可以选择性地抑制PI3Kγ(IC50=0.31μM)。通过流式细胞实验,我们明白了化合物6z抑制T淋巴增殖作用的基本原理,主要是通过诱导激活的T淋巴细胞凋亡,并且6z浓度越大,诱导凋亡作用越强。用AutoDock模拟化合物与PI3Kγ蛋白分子的对接也在分子结构机制上为化合物的生物活性结果提供了一定的支持。因此化合物6z可能是一类有着很好研究前景的以PI3Kγ为作用靶点的免疫抑制剂的先导化合物。
目的：PTEN/PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生、发展中的重要作用已受到越来越多的重视，该通路上基因的表达已被证实可成为预测肺癌、子宫内膜癌等肿瘤预后的重要标志。随着我国生活水平的提高，结肠癌发病率逐年上升，故对结肠癌的诊断、治疗及预测预后愈发重要。目前对于结肠癌组织中PTEN/PI3K/Akt通路的研究相对较少，因此本实验通过对于结肠癌及正常结肠组织中PTEN/PI3K/Akt信号通路上PTEN及PI3K表达的分析，讨论PTEN、PI3K与结肠癌各临床病理因素的关系，PTEN、PI3K在结肠癌中表达的差异以及两者的表达与结肠癌预后的相关性，探讨PTEN、PI3K在结肠癌的发生、发展、预后及临床个体化治疗中的作用。

购买BI 6727 方法：1.选取2008年1月-2011年12月大连医科大学附属第一医院外科术后病理证实的结肠癌组织石蜡标本45例。45例术后结肠癌组织石蜡包埋标本中42例可进行免疫组化实验，具备完整临床病例资料，可纳入实验组。实验组患者术前未进行任何抗肿瘤治疗，术后均接受FOLFOX方案化疗8-12周期，共完成408周期，平均完成10.72个周期。其中左半结肠者30例，右半结肠者12例；男性患者32例，女性患者10例；肿瘤>5cm者21例，≤5cm者21例；年龄37岁-75岁，平均年龄50.5岁，>50岁者37例，≤50岁者5例；高分化7例，中分化21例，低分化14例；有远处转移17例，其中肝转移13例，肺转移3例，腹膜转移1例，无远处转移25例；有淋巴结转移23例，无淋巴结转移19例；未出现化疗副反应不可耐受的病例；随访时间为手术日期至患者复发日期，末次随访时间为：2013年5月。对照组设为42例正常结肠组织。2.检测实验组及对照组中PTEN及PI3K的表达用免疫组织化学二步法。3.统计学分析：将实验数据经SPSS18.0软件进行统计学分析。采用χ2检验分析PTEN、PI3K的阳性表达率与结肠癌临床病理因素的关系及两者不同表达与化疗毒副反应的关系。采用Spearman秩和检验分析PTEN与PI3K在结肠癌中的不同表达有无相关。采用Kaplan-Meier法分析PTEN、PI3K的不同表达与疾病进展时间（TTP）的相关性，用Log-rank检验比较PTEN、PI3K不同表达者的中位TTP差异。检验水准采取双尾α=0.05，P

Transmembrane Transporters modulator 0.05），与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期相关（P 0.05）。 3.42例结肠癌组织中，PTEN阳性表达但PI3K阴性表达为9例，PI3K阳性表达但PTEN阴性表达为13例，PTEN及PI3K同时阳性表达为14例，PTEN、PI3K同时阴性表达为6例。两者的表达呈显著负相关（r=-0.325，P=0.0230.05）。

5.42例结肠癌患者中PTEN阳性表达者的中位TTP为22.17个月，阴性表达者的中位TTP为12.25个月，前者明显高于后者且有统计学意义（χ2=21.429，P=0.0000.05）。 结论： 1.PTEN与结肠癌的发生及疾病进展时间相关，且参与了结肠癌的浸润、转移，有可能作为重要指标评价结肠癌预后。 2.PI3K与结肠癌的发生相关，但与结肠癌的浸润、转移及疾病进展时间无关，与结肠癌预后无相关性。 3.PTEN、PI3K在结肠癌中的表达呈负相关，表明PTEN的缺失可能引起PI3K信号通路的激活，两者均与结肠癌的发生密切相关，可指导结肠癌的个体化治疗。
目的：探讨PI3K抑制剂NVP-BEZ235对人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞的增殖、周期、凋亡及其对Jurkat细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路中Akt、p70s6k磷酸化的影响，以期为提高急性T淋巴细胞白血病的临床治疗提供实验基础。 方法：四甲基偶氮唑蓝(MTT)对不同浓度NVP-BEZ235于不同时间点处理后人急性T细胞白血病Jurkat细胞增殖情况的检测,在此基础上采用流式细胞仪检测经NVP-BEZ235处理过后Jurkat细胞周期的变化及Jurkat细胞凋亡率,并采用Western blotting检测Jurkat细胞中PI3K信号通道中Akt、p70s6k磷酸化是否下调。 BYL719化学结构 结果：NVP-BEZ235处理Jurkat细胞后：细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率较用药前升高；用流式细胞仪检测处理后的Jurkat细胞，发现凋亡率较未用药的空白组明显增高，并且与药物浓度正相关；用流式细胞仪检测周期，结果示NVP-BEZ235对Jurkat细胞有G1/G0期阻滞；经Western blot方法检测显示NVP-BEZ235导致Jurkat细胞Akt、p70s6k蛋白的磷酸化水平显著降低。 结论：急性T淋巴细胞白血病中存在活化的PI3K信号通路。PI3K/mTOR双重抑制剂NVP-BEZ235为急性T淋巴细胞白血病的靶向治疗提供实验依据。
背景：PI3K家族是一个激酶家族,这个家族是调控磷脂代谢途径以及磷脂源信使分子产生的重要催化酶系,目前相关研究主要集中在Ⅰ型PI3K(下文简称PI3K)。前期研究显示,PI3K在动脉粥样硬化、细胞凋亡、炎症反应中均起到了关键的作用,而这三个因素恰巧是腹主动脉瘤发病机制研究中的重要因素。目前,关于PI3K与腹主动脉瘤关系的研究暂未见报道。 目的：通过检测PI3K在人腹主动脉瘤血清中的表达,探讨PI3K在腹主动脉瘤发病机制中的作用及临床意义。 方法：应用酶联免疫吸附测定技术,分别测定PI3K在24例腹主动脉瘤患者的血清标本中的表达,并与24例正常人血清标本中的PI3K表达进行对照研究。并将腹主动脉瘤组根据性别、年龄、瘤体直径、吸烟史、高血压史、血脂异常等相关因素进行分组研究。 结果：在腹主动脉瘤患者血清中PI3K的表达明显高于正常人群,差异有统计学意义(P=0.015),且与患者的性别、年龄、瘤体直径、吸烟史、高血压史、血脂异常无明显相关(P>0.

25±0.26)g、(0.72±0.11)g、(0.69±0.07)g、(0.52±0.07)g。TMZ+AKT2干扰组其肿瘤体积及瘤体质量都明显小于空白对照组、替莫唑胺组和TMZ+阴性对照组，有显著性差异（P＜0.05）。免疫组化和Real-time 点击此处 PCR实验表明TMZ+AKT2干扰组比其他对照组AKT2表达程度显著降低（P＜0.05）。TUNEL实验结果显示：空白对照组、替莫唑胺化疗组、TMZ+阴性对照组、TMZ+AKT2干扰组裸鼠瘤体凋亡指数分别为：(7.15±1.04)%、(25.26±2.71)%、(26.63±3.46)%、(42.81±5.97)%。TMZ+AKT2干扰组其肿瘤凋亡情况明显高于空白对照组、替莫唑胺组和TMZ+阴性对照组，结果有显著性差异（P＜0.05）。

结论: RNA干扰AKT2能够显著提高裸鼠胶质母细胞瘤对TMZ化疗的敏感性。 第三部分胶质瘤替莫唑胺化疗耐药细胞株的建立及其特性鉴定 目的：建立U251耐替莫唑胺的稳定细胞株，并对该细胞株U251/TMZ的生物学特性进行研究鉴定。 方法：通过从低药物浓度开始逐步增加U251细胞培养基中化疗药物替莫唑胺的浓度，建立对TMZ化疗耐药的胶质母细胞瘤U251/TMZ。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法，计算出两种细胞株的半数细胞抑制浓度(IC50)及耐药系数(RI)。流式细胞仪测定U251和U251/TMZ两组细胞周期的分布情况。利用蛋白芯片技术对U251和U251/TMZ两种细胞株中1358中常见蛋白进行测定和分析。 结果：替莫唑胺对U251细胞株的IC50为(10.78±0.72)μg/ml，替莫唑胺对U251/TMZ的IC50为(45.42±3.17) μg/ml，细胞增殖实验所测结果计算后的耐药指数为4.21(P
背景： 多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种单克隆浆细胞异常增生的恶性肿瘤,以产生单克隆免疫球蛋白为特征。目前MM的治疗主要包括传统化疗、新药靶向治疗及免疫治疗等。虽然新的靶向治疗明显提高了MM的疗效,但患者中位生存时间仍在3～5年,普遍存在复发难治现象,MM仍然被认为是一种不可治愈的疾病。因此,进一步研究影响MM细胞生长的相关机制,寻找新的靶向治疗策略,是临床亟需解决的问题。 最近,糖尿病与肿瘤的关系受到人们的关注。有研究显示糖尿病与MM亦存在相关性。糖尿病患者存在胰岛素抵抗,导致体内胰岛素(insulin, I)及胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)水平升高,而I/IGF介导的PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤细胞包括MM细胞增殖及耐药中起重要作用。二甲双胍(Metformin, Met)是一种安全高效的双胍类降糖药,作为胰岛素增敏剂,Met能够通过减少肝糖原异生,增加周围组织对胰岛素的敏感性、抑制肠道细胞吸收葡萄糖发挥降糖作用,有效降低血液胰岛素水平。因此,二甲双胍有可能通过影响I/IGF通路抑制MM细胞增殖。同时,在细胞能量代谢研究中发现,二甲双胍是能量调控信号分子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated

Alectinib制造商 protein kinase, AMPK)的激动剂,激活AMPK负向调控下游哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target ofrapamycin,mTOR)通路可能是其抗肿瘤作用的又一机制。但AMPK在肿瘤中是癌基因还是抑癌基因尚存在争议,其受上游肝激酶B1/丝苏氨酸激酶11(live kinase B1/serine/threonine protein kinase11,LKB1/STKl1)的调控,LKB1/STK141的表达缺失或基因突变所致功能缺失都会影响二甲双胍对AMPK的激活。有关LKB1/AMPK在骨髓瘤中的作用目前仍不清楚。本课题拟探讨二甲双胍对骨髓瘤细胞的作用及其具体分子机制,初步探讨AMPK在骨髓瘤中的作用角色。目的：

本研究旨在探讨二甲双胍对骨髓瘤细胞株及原代MM细胞增殖、凋亡、周期阻滞的影响,并寻找其与现有化疗药物的联合作用。在此基础上,明确二甲双胍对PI3K/AKT/mTOR通路及AMPK/mTOR双信号通路的影响,探索二甲双胍抑制骨髓瘤细胞增殖的具体分子机制。进一步利用重症联合免疫缺陷鼠(SCID鼠)构建MM移植瘤小鼠模型,在体内验证二甲双胍及联合用药抗骨髓瘤作用效果。同时,构建敲除AMPK的慢病毒载体转染MM细胞,探讨AMPK对MM细胞生物学行为的影响,初步揭示AMPK在MM中的角色。方法： 和 1.利用MTT法测定二甲双胍对骨髓瘤细胞株细胞及原代细胞增殖的影响,流式细胞仪检测二甲双胍作用后对细胞周期及凋亡的影响。 2.MTT法检测二甲双胍与硼替佐米、地塞米松的联合作用,采用Chou-Talalay法判断联合效果,联合指数(combination index,CI)1为拮抗作用。 3.Western blot及流式细胞仪进一步检测二甲双胍单药及联合用药时凋亡相关蛋白、周期相关蛋白的改变。 4.Western blot检测IGF-IR/PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR信号通路的改变,加用IGF-I(100ng/ml)及PI3K抑制剂LY294002(10μgM或5μM)验证. 5.皮下注射MM.1S细胞(1×107)构建多发性骨髓瘤移植瘤小鼠模型,在体内验证二甲双胍单药及联合用药效果及对生存的影响。 6.构建敲除／AMPK的慢病毒载体转染MM细胞,观察其对MM细胞增殖、凋亡及周期的改变,在此基础上加用二甲双胍观察其疗效改变；利用基因测序技术检测肝激酶B1／丝苏氨酸蛋白激酶11基因(lkbl/stkll基因)是否存在突变,初步了解LKB1/AMPK在骨髓瘤中的角色。 结果： 1.MTT检测发现二甲双胍能够抑制MM细胞增殖,并且呈时间及剂量依赖性,48小时的IC50为5.95mM到32.18mM；流式检测发现二甲双胍能够诱导MM细胞凋亡及细胞周期阻滞于G1期,诱导凋亡在MM.1S细胞最明显。10mM二甲双胍处理MM细胞株48h后细胞明显阻滞于G1期,对照组与二甲双胍处理组G1期的比例分别：RPMI8226,28.09±2.40%vs38.65±2.51%(p=0.0063); MM.1S,52.44±0.89%vs65.75±3.41%(p=0.0028); MM.1R,50.64±3.17%vs81.50±2.71%(p=0.0002). 2.MTT检测发现二甲双胍与地塞米松存在联合作用(CI1),进一步利用western blot及流式细胞仪检测验证二甲双胍联合地塞米松或硼替佐米的联合作用,发现二甲双胍与地塞米松在RPMI8226细胞中主要通过周期阻滞于G1期发挥联合作用,而在MM.1S中,主要通过诱导凋亡发挥联合作用。 3.

5厘米大小时)进行实验。挑选35只肿瘤负荷较相近小鼠随机分为空白对照组、常山酮组、放射治疗组、放射治疗联合常山酮组,放射治疗联合TGF-β抑制剂组,每组7只。对照组不做处理;常山酮组于接种后第6天至第15天予常山酮腹腔给药,每只鼠2ug/0.1ml/d;放射治疗组于接种后第8天、9天给予移植瘤6MV-X线照射,放射治疗剂量为10Gy×2;放射治疗联合常山酮组给药处理同常山酮组,放射治疗的时间及剂量同放射治疗组;放射治疗联合抑制剂组于接种后第6天至第15天予TGF-β抑制剂(SB431542终浓度1u M)腹腔给药,每只小鼠0.1ml/d,放射治疗处理同放射治疗组。自治疗开始每隔l天用游标卡尺测量瘤径。接种后第15天(照射结束后第6天)各组随机处死3只小鼠,取脾脏制备单细胞悬液后行FACS检测脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞Treg细胞含量;剥离小鼠肿瘤组织,一部分制备单细胞悬液行FACS检测肿瘤组织浸润淋巴细胞中Treg细胞含量,剩余部分福尔马林固定及冻存并通过免疫组织化学、Elisa、Western

Blot等技术研究不同处理组移植瘤TGF-β信号传导通路的变化;剩余小鼠观察移植瘤生长抑制情况,并计算生存期。结果:流式结果显示:空白对照组、常山酮组肿瘤浸润淋巴细胞中Treg含量无明显差异(P=0.989),放射治疗组肿瘤浸润淋巴细胞中Treg含量较对照组明显升高(P<0.001),联合应用常山酮或TGF-β抑制剂组肿瘤组织浸润淋巴细胞中Treg含量较放射治疗组明显下降(P值均0.05),放射治疗结束后第5天,放射治疗组、放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组移植瘤体积开始小于对照组(P值分别为0.008、0.023、0.007),放射治疗组、放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组肿瘤体积无统计学差异(P值均>0.5),放射治疗结束后第9天,放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组肿瘤体积开始小于放射治疗组(P值分别为0.049、0.025),治疗后各时间点放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组肿瘤体积均无明显差异(P值均>0.05)。空白对照组及常山酮组小鼠生存期无统计学差异(P=0.784),OS分别为28天和34天,放射治疗组、放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组生存期均显著长于空白对照组(P值均<0.05)。结论:常山酮可以改善电离辐射所致的肿瘤免疫抑制状态并增强放射治疗疗效,其可能作用机制是通过抑制肿瘤细胞内TGF-β信号传导通路来实现的。
目的：研究烟草提取物(CSE)对体外培养的大鼠II型肺泡上皮细胞的影响并探究其中的潜在机制。方法：1.体外培养大鼠肺泡上皮RLE-6TN细胞株24

selleck chemicals MLN2238购买 h后,分别加入0.5%,1.0%和2.0%CSE共培养48 h, Hoechst染色法检测烟草提取物对细胞核变化的影响；流式细胞术检测细胞早期凋亡率；蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测转化生长因子(Transforming Growth Factor-betal,TGF-β1), smad2的表达量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3裂解片段(Cleaved caspase-3)的活性。2.TGF-β1受体抑制剂(SB431542) 500 nmol·L-1作用RLE-6TN细胞株24h后,加入2.0%CSE共培养48 h。Western blot分别检测Smad2和Cleaved caspase-3的活性。 结果：1.经不同浓度的CSE(0.5%,1.0%,2.0%)作用RLE-6TN细胞48 h后,经Hoechst染色后,各CSE处理组均可见部分凋亡细胞,胞核发白、固缩、染色质边集等现象,对照组细胞核呈现均匀的淡蓝色荧光。随机视野内凋亡细胞百分数分别为：对照组(3.671±1.04)%,0.5%CSE处理组(16.606±6.645)%,1.0%CSE处理组(18.626±3.596)%以及2.0%CSE处理组(31.035±4.373)%,各CSE处理组凋亡细胞百分数较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.流式细胞术发现细胞早期凋亡率分别为：对照组(5.270±0.526)%,0.5%CSE处理组(22.563±1.048)%,1.0%CSE处理组(27.467±0.735)%以及2.0%CSE处理组(32.580±0.413)%,各CSE处理组细胞早期凋亡率与对照组比较,差异有统计学意义(PSmad2、磷酸化smad2

和 (p-Smad2)蛋白表达量与Cleaved caspase-3活性较对照组明显增加,差异有统计学意义(P
目的：观察香烟烟雾提取物(Cigarette smoke extract, CSE)是否导致大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Rat alveolar Type Ⅱ epithelial cell, RLE-6TN)细胞周期的改变以及在这其中转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)是否有发挥作用。方法：选用健康清洁级SD雄性大鼠8只(重量：180～220g),完全随机平均分配为对照组、烟熏组,每组4只,给予烟熏组大鼠暴露于香烟烟雾中每天6小时连续3天,于第4天处死动物后取肺组织,进行石蜡包埋切片后,HE染色观察结构改变,免疫组化法测定CyclinD1的表达情况。体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,除对照组外,其余各组分别予0.25%、0.5%、1%浓度的CSE刺激48 h。TGF-β1受体抑制剂(SB431542)预处理细胞6 h,实验设计为对照组、1%CSE组、SB431542组、1%CSE+SB431542组,CSE刺激48 h。各组细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后收集细胞,分别采用流式细胞仪检测细胞周期,ELISA、Western blot法测定TGF-β1、CyclinD1蛋白的表达情况。结果：烟熏组大鼠肺组织发生形态学及病理学的改变,TGF-β1表达增加、CyclinD1表达抑制(与对照组比较)。CSE暴露干预细胞后,G1期细胞的比例呈浓度依赖性与时间依赖性的增高,同时TGF-β1表达增加、CyclinD1表达抑制(与空白对照组比较P<0.

成功构建了针对GSK-3β基因一个位点的RNAi腺病毒表达载体,经PCR和测序鉴定干扰片断的碱基序列及插入位点完全正确;2.在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒,获得高滴度腺病毒上清;3.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以高效抑制GSK-3β蛋白的表达,且对GSK-3β蛋白的抑制作用可持续六天以上;4.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以明显增加细胞内β-catenin的蛋白水平,且随着MOI值增加和时间延长β-catenin蛋白量进一步增加;5.腺病毒和/或FFA(0.75 mmol/L)干预HUVEC,72h、96h后Brdu和流式细胞检测,FFA组与正常细胞相比,细胞增殖率明显下降,细胞凋亡率明显增加;RNAi腺病毒组与空病毒组相比,细胞增殖率明显增加,细胞凋亡率差别不明显;RNAi腺病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率增加,细胞凋亡率减少;空病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率和凋亡率差别均不明显。

购买OSI-744 结论:构建的GSK-3β特异的RNAi腺病毒能够有效抑制GSK-3β基因的表达,增加细胞内β-catenin蛋白水平,可以作为研究Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路的重要技术手段;上调Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路可保护高游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞损伤。
目的:通过研究体外培养的心肌细胞,利用心肌细胞急性缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤,通过观察CT-1(Cardiotrophin-1)对急性缺氧复氧时心肌细胞成活率,心肌细胞凋亡,心肌肌酸激酶,线粒体模电位(△Ψm)等的影响,探讨CT-1在心肌细胞缺氧复氧损伤中所起的作用及机制,通过CT-1信号通路PI-3K/GSK3β阻断剂LY294002干预,从分子水平阐明PI-3K/GSK3β介导心肌营养素-1对心肌细胞缺氧复氧损伤中的保护作用。 方法: 1.乳鼠心肌细胞培养:取出生1-3天的SD大鼠心肌组织,按改良的Simpson等方法进行分次水浴搅拌消化,差速贴壁法纯化心肌细胞,以1×106/cm2的细胞密度接种于35mm培养皿。 Dolutegravir溶解度 2.缺氧复氧模型的建立:心肌细胞生长接近会合状态,呈现同步搏动时开始实验。模拟缺血溶液配制缺氧液,以95%N2-5%CO2预饱和1h,将培养的细胞经缺氧液缺氧3h,之后换成复氧液培养3h。 3.实验分组:(分5组) (1)对照组:更换培养基后CO2孵箱中正常培养; (2)缺氧复氧组:缺氧3h,复氧3h处理; (3)缺氧复氧+CT-1组:缺氧3h后,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(4)缺氧复氧+CT-1+LY294002组(PI3K/GSK3β阻断剂):缺氧3h,加入终浓度为10umol/l的LY294002,10min后加CT-1(10ng/ml),再进行复氧3h处理;

(5)缺氧复氧组+CT-1+DMSO组:缺氧3h,加DMSO(助溶剂)10min后加CT-1(10ng/ml),进行复氧3h处理。 结果 1.心肌细胞搏动频率与节律:各组基线心肌细胞搏动频率均为148次/分左右,各组无明显差异,节律规整。缺氧复氧后心肌细胞搏动频率教复氧前明显减缓,搏动幅度减弱,节律不规整。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧前比较无明显减慢,与对照组相近,节律整齐。而阻断剂LY294002干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则,而助溶剂DMSO并不干扰CT-1的作用。表明LY294002特异性阻断了CT-1对缺氧复氧损伤的心肌细胞的保护作用。

2.心肌细胞的损伤:对照组心肌细胞存活率为96.2±3.2%,凋亡率为2.8±0.4%。缺氧复氧损伤后心肌细胞存活率明显降低,为76.8±4.6%,心肌细胞凋亡率明显上升(19.4±2.3%),二者差异有显著意义(P<0.05),心肌酶LDH和CK-MB较对照组升高。CT-1处理的心肌细胞,明显抑制LDH,CK-MB的升高和凋亡的增加,存活率较缺氧复氧组明显升高(89.8±8.3%VS78.8±4.6%,P<0.01),CT-1组较缺氧复氧升高(69.13±6.84VS40.55±4.25,P0.05),表明CT-1激活了PI3K途径使磷酸化PI3K蛋白水平表达升高。 Baf-A1 solubility dmso 5.心肌细胞GSK3β蛋白表达和磷酸化状态:各组经3小时缺氧,3小时复氧后,心肌细胞GSK3β蛋白表达差异无统计学意义。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化GSK3β蛋白表达明显减少,而CT-1组较缺氧复氧组显著上升,加PI3K/GSK3β阻断剂后磷酸化GSK3β蛋白表达明显减少,而助溶剂组与CT-1组无明显差异,表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞磷酸化的作用,PI3K/GSK3β阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。 6.心肌细胞Caspases3蛋白表达:各组蛋白上样量无明显差异,经缺氧复氧后,缺氧复氧组较空白对照组Caspases3蛋白表达明显升高(0.953±0.015VS0.329±0.017,P<0.05),CT-1组较缺氧复氧组Caspases3蛋白表达明显减少(0.412±0.034VS0.953±0.015,P0.05),表明CT-1有抑制缺氧复氧心肌细胞凋亡的作用,PI3K/GSK3β阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。 结论: 1. CT-1能减轻缺氧复氧引起的心肌细胞损伤,表现在:改善心肌细胞搏动频率与节律,提高心肌细胞存活率和降低凋亡率,降低心肌细胞LDH和CK-MB水平。 2. CT-1通过提高心肌细胞线粒体膜电位,降低Caspases3蛋白表达,从而抑制心肌细胞凋亡。 3.