成功构建了针对GSK-3β基因一个位点的RNAi腺病毒表达载体,经PCR和测序鉴定干扰片断的碱基序列及插入位点完全正确;2.在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒,获得高滴度腺病毒上清;3.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以高效抑制GSK-3β蛋白的表达,且对GSK-3β蛋白的抑制作用可持续六天以上;4.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以明显增加细胞内β-catenin的蛋白水平,且随着MOI值增加和时间延长β-catenin蛋白量进一步增加;5.腺病毒和/或FFA(0.75 mmol/L)干预HUVEC,72h、96h后Brdu和流式细胞检测,FFA组与正常细胞相比,细胞增殖率明显下降,细胞凋亡率明显增加;RNAi腺病毒组与空病毒组相比,细胞增殖率明显增加,细胞凋亡率差别不明显;RNAi腺病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率增加,细胞凋亡率减少;空病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率和凋亡率差别均不明显。
购买OSI-744 结论:构建的GSK-3β特异的RNAi腺病毒能够有效抑制GSK-3β基因的表达,增加细胞内β-catenin蛋白水平,可以作为研究Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路的重要技术手段;上调Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路可保护高游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞损伤。
目的:通过研究体外培养的心肌细胞,利用心肌细胞急性缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤,通过观察CT-1(Cardiotrophin-1)对急性缺氧复氧时心肌细胞成活率,心肌细胞凋亡,心肌肌酸激酶,线粒体模电位(△Ψm)等的影响,探讨CT-1在心肌细胞缺氧复氧损伤中所起的作用及机制,通过CT-1信号通路PI-3K/GSK3β阻断剂LY294002干预,从分子水平阐明PI-3K/GSK3β介导心肌营养素-1对心肌细胞缺氧复氧损伤中的保护作用。 方法: 1.乳鼠心肌细胞培养:取出生1-3天的SD大鼠心肌组织,按改良的Simpson等方法进行分次水浴搅拌消化,差速贴壁法纯化心肌细胞,以1×106/cm2的细胞密度接种于35mm培养皿。 Dolutegravir溶解度 2.缺氧复氧模型的建立:心肌细胞生长接近会合状态,呈现同步搏动时开始实验。模拟缺血溶液配制缺氧液,以95%N2-5%CO2预饱和1h,将培养的细胞经缺氧液缺氧3h,之后换成复氧液培养3h。 3.实验分组:(分5组) (1)对照组:更换培养基后CO2孵箱中正常培养; (2)缺氧复氧组:缺氧3h,复氧3h处理; (3)缺氧复氧+CT-1组:缺氧3h后,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(4)缺氧复氧+CT-1+LY294002组(PI3K/GSK3β阻断剂):缺氧3h,加入终浓度为10umol/l的LY294002,10min后加CT-1(10ng/ml),再进行复氧3h处理;
(5)缺氧复氧组+CT-1+DMSO组:缺氧3h,加DMSO(助溶剂)10min后加CT-1(10ng/ml),进行复氧3h处理。 结果 1.心肌细胞搏动频率与节律:各组基线心肌细胞搏动频率均为148次/分左右,各组无明显差异,节律规整。缺氧复氧后心肌细胞搏动频率教复氧前明显减缓,搏动幅度减弱,节律不规整。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧前比较无明显减慢,与对照组相近,节律整齐。而阻断剂LY294002干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则,而助溶剂DMSO并不干扰CT-1的作用。表明LY294002特异性阻断了CT-1对缺氧复氧损伤的心肌细胞的保护作用。
2.心肌细胞的损伤:对照组心肌细胞存活率为96.2±3.2%,凋亡率为2.8±0.4%。缺氧复氧损伤后心肌细胞存活率明显降低,为76.8±4.6%,心肌细胞凋亡率明显上升(19.4±2.3%),二者差异有显著意义(P<0.05),心肌酶LDH和CK-MB较对照组升高。CT-1处理的心肌细胞,明显抑制LDH,CK-MB的升高和凋亡的增加,存活率较缺氧复氧组明显升高(89.8±8.3%VS78.8±4.6%,P<0.01),CT-1组较缺氧复氧升高(69.13±6.84VS40.55±4.25,P0.05),表明CT-1激活了PI3K途径使磷酸化PI3K蛋白水平表达升高。 Baf-A1 solubility dmso 5.心肌细胞GSK3β蛋白表达和磷酸化状态:各组经3小时缺氧,3小时复氧后,心肌细胞GSK3β蛋白表达差异无统计学意义。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化GSK3β蛋白表达明显减少,而CT-1组较缺氧复氧组显著上升,加PI3K/GSK3β阻断剂后磷酸化GSK3β蛋白表达明显减少,而助溶剂组与CT-1组无明显差异,表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞磷酸化的作用,PI3K/GSK3β阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。 6.心肌细胞Caspases3蛋白表达:各组蛋白上样量无明显差异,经缺氧复氧后,缺氧复氧组较空白对照组Caspases3蛋白表达明显升高(0.953±0.015VS0.329±0.017,P<0.05),CT-1组较缺氧复氧组Caspases3蛋白表达明显减少(0.412±0.034VS0.953±0.015,P0.05),表明CT-1有抑制缺氧复氧心肌细胞凋亡的作用,PI3K/GSK3β阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。 结论: 1. CT-1能减轻缺氧复氧引起的心肌细胞损伤,表现在:改善心肌细胞搏动频率与节律,提高心肌细胞存活率和降低凋亡率,降低心肌细胞LDH和CK-MB水平。 2. CT-1通过提高心肌细胞线粒体膜电位,降低Caspases3蛋白表达,从而抑制心肌细胞凋亡。 3.