5mmol/L，HG组给予D-glucose30mmol/L，为了控制高渗透压对细胞实验结果的影响，MG组应用24.5mol/L甘露醇+D-glucose5.5mmol/L作为对照。各组细胞同步培养48小时后收集，应用western blot和real-time PCR方法检测gremlin1蛋白和mRNA在高糖环境足细胞中的表达；应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1在足细胞中的分布情况及定位特点。 2重组gremlin1对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响 应用重组的小鼠gremlin1细胞因子与高糖共同刺激足细胞，模仿生物体内高糖环境下gremlin1过表达的情形。①首先探讨gremlin1对高糖环境足细胞发生作用的最佳浓度和时间，即量效和时效关系实验。用高糖分别混合0、0.1、0.25、0.5、0.75、1μg/ml的gremlin1培养分化成熟的足细胞48小时，应用western blot和real-timePCR方法，找出gremlin1对足细胞nephrin和synaptopodin负性调控最明显的浓度作为下一步应用gremlin1的浓度依据。其次应用高糖混合最佳作用浓度的gremlin1因子分别培养成熟足细胞0、6、12、24、48、72小时，找出gremlin1对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin负性调控作用的最佳时间。②在最佳gremlin1作用浓度(0.75μg/ml)和时间(48h)条件下，分别设置正常对照（NC）、高糖对照(HG)和高糖+gremlin1(HG+grem1)对照，应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1对足细胞nephrin和synaptopodin表达和定位的影响，直观分析gremlin1对足细胞的损伤作用。③设置对照如上，应用TUNEL检测gremlin1对足细胞凋亡的影响。计数TUNEL阳性细胞数。④应用western、real-time
Procaspase activation GDC-0199制造商 PCR方法检测Bcl-2、Bax、Cleaved Casepase-3等凋亡相关蛋白表达，以弥补TUNEL方法缺陷，与TUNEL一起共同评价gremlin1对高糖足细胞凋亡的影响。 3Gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响 分化成熟的足细胞分为高糖组(HG)、高糖+gremlin1-siRNA组(HG+grem.siRNA)和高糖+对照siRNA组(HG+con.siRNA)。①优化转染条件，找出化学合成的gremlin1-siRNA沉默gremlin1基因表达的最佳剂量。②应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin表达及定位的影响，评价gremlin-siRNA对足细胞的影响。③应用western blot和real time PCR的方法观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin表达的影响。④应用TUNEL方法观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞凋亡的影响，并计数TUNEL阳性细胞。⑤检测gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞Bcl-2、Bax和Cleaved DNA Damage抑制剂 Caspase-3等凋亡相关蛋白表达的影响，进一步印证gremlin1-siRNA对足细胞凋亡的影响。 4介导gremlin1对高糖环境足细胞损伤的信号机制研究 ①由于在DN肾组织上发现TGF-β1和gremlin1表达共定位，因此我们研究高糖环境时二者之间是否存在特定关系。将分化成熟的高糖培养的足细胞分为两组，一组高糖培养基中加入重组的gremlin1细胞因子（0.75μg/ml）共同孵育48小时，检测TGF-β1的蛋白和mRNA表达情况（HG+grem1组）；另一组采用高糖培养基中加入重组的TGF-β1细胞因子（5ng/ml）共同孵育48小时，检测gremlin1的蛋白和mRNA表达情况（HG+TGF-β1组）；另外设置正常对照组（NC）和高糖对照组(HG)分别检测gremlin1和TGF-β1的表达。②与gremlin1相关的TGF-β信号分子的检测：用高糖与重组gremlin1（0.75μg/ml）共同孵育足细胞0、15、30、60、120、240分钟后，检测smad2/3、p-smad2/3、p38、p-p38、JNK1/2、p-JNK1/2等经典与非经典TGF-β信号分子，找出与gremlin1具有时效关系的信号途径进行阻断实验研究，以期发现其中的调控机制。③上述实验结果发现TGF-β/smad2/3信号途径与gremlin1作用相关。应用TGF-β1受体阻断剂SB431542阻断TGF-β1信号，观察TGF-β1受体阻断后对gremlin1抑制的nephrin和synaptopodin蛋白表达的影响。④应用smad2/3-siRNA转染高糖和gremlin1共同培养的小鼠足细胞，48小时后收获细胞，验证smad2/3敲减效果，并检测smad2/3敲减后对gremlin1抑制的nephrin和synaptopodin蛋白表达的影响。
结果： 1Gremlin1在高糖环境足细胞中的表达与分布 ①足细胞F-actin免疫荧光染色结果显示，在33℃，γ-IFN存在的许可条件下培养，足细胞呈梭形或三角形，细胞突起较少。在37℃，无-IFN的非许可条件下培养10-14天后，足细胞胞体上伸出大量足突，胞浆向四周展开，呈树枝状。Synaptopodin免疫荧光染色结果显示，未分化足细胞胞浆中synaptopodin的表达几乎没有，而分化10天后的足细胞中synaptopodin的表达明显增强，提示足细胞已分化成熟。②Western blot结果：在正常对照及甘露醇对照组，gremlin1蛋白表达很少，而HG组gremlin1表达明显上调(p<0.