75%)阳性,其中阳性(+):39例(48.75%),强阳性(++):28例(35%),在NOM中不表达。C-Met蛋白高表达与TNM分期、组织学分化及有无淋巴结转移有关(P0.05)。 3.AMFR表达与C-Met蛋白表达间的关系28例AMFR表达强阳性中有19例C-Met蛋白表达亦是强阳性,Pearson’s相关分析得出它们之间的相关系数rs=0.482,P
第一部分小白菊内酯对多发性骨髓瘤细胞化疗增敏作用 目的:研究小白菊内酯(parthenolide,PTL)联合阿霉素(ADM)或地塞米松(Dex)抗多发性骨髓瘤细胞的作用。 方法:采用多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞为研究对象,将PTL(0、0.5、1、2μmol/L)分别与ADM(0、0.01563、0.03125、0.0625、0.0125、0.25、0.5、1、2、4、8μmol/L)、Dex(0、0.001、0.005、0.025、0.125、0.625μmol/L),作用不同时间(48h、72h),应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析细胞增殖;Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,荧光显微镜下观察丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色后的细胞形态变化。 结果:(1)ADM单用48h,RPMI8226细胞的IC50为0.55±0.06μmol/L,与PTL(0.5、1、2μmol/L)联用后,分别降低为0.51±0.04μmol/L、0.28±0.03μmol/L(p
目的:研究肝癌患者TACE(transcatheter

Doxorubicin购买 arterial chemoembolization)前后血清肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)水平的动态变化,分析影响肝癌患者TACE术前、术后血清HGF水平的因素,探讨其临床意义。 材料与方法:以37例慢性乙型肝炎基础上的肝癌患者为研究对象,用酶联免疫吸附法(enzyme

linked immunosorbent assay, ELISA)测定TACE术前1天,术后第3、7、28天血清HGF浓度,分析术前血清HGF水平与性别、年龄、肿瘤分期、肿瘤大小、术前肝功能Child-Pugh分级、术前血清甲胎蛋白水平以及有无门静脉癌栓等不同影响因素之间的关系,分析血清HGF水平与肿瘤转移的关系,分析栓塞范围与术后血清HGF水平变化的关系。并以15例健康献血者作为正常对照组,以15例慢性乙型肝炎患者及15例慢性乙型肝炎肝硬化患者作为慢性肝炎组和肝硬化组。 结果:肝癌患者TACE术前血清HGF浓度为[(0.69±0.17)ng/ml],显著高于正常对照组[(0.24±0.05)ng/ml]、慢性肝炎组[(0.34±0.06)ng/ml]以及肝硬化组[(0.38±0.10)ng/ml] (P<0.01)。影响术前血清HGF水平的主要因素有:肿瘤分期、肿瘤大小以及门静脉癌栓。13例肝癌患者TACE术后发现肿瘤转移,其术前、术后血清HGF水平均显著高于未发现肿瘤转移的患者(P0.8ng/ml,而血清HGF水平
背景: 喉癌占全身恶性肿瘤的1%～5%,是头颈部最常见的肿瘤之一,占头颈部肿瘤的13.9%,我国部分地区发病率约为1.5～3.4/10万人,已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病,以鳞癌多见。虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗、化疗等已有很大改进,提高了患者的五年生存率,但手术治疗易使患者的喉功能严重破坏而致残;放疗仅对早期喉癌疗效好,对于大多数就诊时即为中、晚期或治疗后又出现复发、转移的患者往往效果不佳;而化疗又由于毒副作用严重常使得患者无法耐受,从而使这些治疗方式仍受到很大限制。因此,积极寻求治疗喉癌的新途径即成为耳鼻咽喉科研究者面临的新课题。 ABT-263研究购买 selleck screening library 肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一种多功能的细胞因子,为一种多肽,其生物学活性由c-Met蛋白所介导。c-Met蛋白属酪氨酸激酶活性的生长因子受体,研究发现其在促进细胞增殖分化、细胞扩散、新生血管的生成方面具有重要作用。异常表达的c-Met激活下游分子导致肿瘤的发生、发展和转移。研究表明c-Met在喉癌中强表达,与喉癌的增殖及转移关系密切。RNA干扰技术具有特异、有效的基因沉默效应,能够简单、高效地抑制特定基因的表达,目前已成为肿瘤基因治疗研究的热点。 本研究构建了表达c-Met shRNA的重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA,并在脂质体的介导下转染人喉癌Hep-2细胞株。应用RT-PCR及Western-Blot技术,比较研究了转染前后c-Met表达的变化;并通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后Hep-2细胞的生长、运动及侵袭能力,考察c-Met基因成为喉癌治疗的靶基因的可行性。 目的: 设计以人c-Met基因为靶向的shRNA,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其转染人喉癌Hep-2细胞后抑制c-Met

mRNA及蛋白表达的效应,筛选RNAi作用最强的shRNA片段。并探讨c-Met-siRNA在体外对Hep-2细胞生长、运动、侵袭的影响。 方法: 1.设计3对针对c-Met基因不同位点的shRNA片段,退火形成双链DNA,再与经双酶切后的载体Psilencer2.0-U6连接,构建携带此shRNA的重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,并进行序列测定。 2.利用构建成功的重组质粒,通过脂质体介导的方法将其转染到喉癌Hep-2细胞株中。采用RT-PCR及Western-Blot法检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达的变化,判断各shRNA的干扰效应;筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列。 3.通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法(取转染后细胞生长24h、48h、72h、96h四个时间点)、运动实验及侵袭实验(通过构建transwell小室)比较重组质粒转染Hep-2细胞前后细胞的生长、运动及侵袭能力。 结果: 1.重组质粒转化DH5α菌株经氨卞青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。 2.双酶切鉴定显示重组质粒含有BamHⅠ及HindⅢ酶切位点。 3.经测序,模板序列与设计序列完全正确,重组质粒构建成功。 4.通过脂质体转染三种干扰质粒后,RT-PCR法检测c-Met基因的mRNA表达水平,显示三组均下调,以重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA2效应最显著(p=0.003)。 5.经Western-Blot法检测,通过脂质体转染三种干扰质粒后,c-Met蛋白的表达水平均下调,以重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA2效应最显著(p=0.02)。 6.pSilencer2.

高血压肾损害的中医学理论研究 2.高血压肾损害的现代医学研究 第二部分实验研究 12周龄雄性白发性高血压大鼠(SHR)32只按照完全随机方法分为4组(每组8只),即：高血压模型(SHR)组、潜阳育阴颗粒组、盐酸贝那普利(洛丁新)组、潜阳育阴颗粒+盐酸贝那普利(洛汀新)组；选择年龄、性别配对的12周龄雄性Wistar-Kyoto (WKY)大鼠8只作为正常对照组,均自由饮水,为期8周,并检测以下指标。 1.评价潜阳育阴颗粒对SHR肾损害模型的血压及肾损害指标的实验研究。8周末,无创套尾法测量各组大鼠清醒状态下给药前后血压变化；代谢笼鼠接取24h尿液,采用全自动生化仪检测大鼠尿微量白蛋白(Microalbuminuria,尿m-Alb)、尿N-乙酰β-氨基葡萄糖酐酶(Urinary

Idelalisib制造商 N-acetyl beta glucosamine anhydride enzyme,尿NAG)含量；HE染色评价肾脏病变；Masson染色评价肾脏纤维化程度。 2. Western Blot法检测潜阳育阴颗粒对SHR肾损害模型肾组织TGF-β1、TIMP-1、 MMP-9、Col-Ⅳ蛋白表达的影响。 3.免疫荧光技术标记肾脏组织TGF-β1, Real time-PCR法检测潜阳育阴颗粒对SHR肾损害模型TGF-β1mRNA基因表达的影响。 结果： 1.给药干预前,WKY组与其他各组血压比较均有显著统计学意义(P0.05),造模成功；给药8周后,与WKY组比,SHR模型组血压显著升高(P<0.01),有统计学意义；与SHR组比,潜阳育阴颗粒组、盐酸贝那普利组、潜阳育阴颗粒+盐酸贝那普利组血压显著降低(P<0.01或P<0.05),有统计学意义,其中联合用药组降低血压效果尤为显著(P<0.01),有显著差异；与SHR组比,潜阳育阴颗粒组、盐酸贝那普利组、潜阳育阴颗粒+盐酸贝那普利组尿m-ALB、尿NAG含量均显著下降(P<0.01或P<0.05),有统计学意义,其中联合用药组尤为显著(P<0.01),有显著差异；与SHR模型组比,潜阳育阴颗粒组、盐酸贝那普利组、潜阳育阴颗粒+盐酸贝那普利组肾脏病变积分明显下降(P<0.01或P<0.05),有统计学意义,其中联合用药组优于其它各组(P<0.01),有显著差异；与SHR模型组比,潜阳育阴颗粒组、盐酸贝那普利组、潜阳育阴颗粒+盐酸贝那普利组肾脏纤维化指数均显著下降(P<0.01或P<0.05),有统计学意义,其中联合用药组下降尤为显著(P<0.01或P<0.05),有统计学意义,其中联合用药组尤为明显(P<0.01),有显著差异；与SHR组比,潜阳育阴颗粒组、盐酸贝那普利组、潜阳育阴颗粒+盐酸贝那普利组TGF-β1mRNA基因表达较显著下降(P<0.01或P<0.05),有统计学意义,其中联合用药组尤为显著(P
目的：哮喘在中医学领域内定义为喘、哮证[1]。哮喘的发病机制是复杂的。中医学普遍认为肺、脾、肾三脏功能失调和诱发哮喘病发密切相关，三脏共同调节体内水液代谢的正常运行，当三者功能失调时，聚湿成痰，停滞于肺，是诱发哮喘的潜在根源[2]。现代病理学研究认为，各种炎性细胞（如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等）及炎性介质的共同参预产生了慢性过敏反应致使哮喘的发生。本课题拟通过建立哮喘发作期小鼠动物模型，探讨蝎黄解痉治哮颗粒调节哮喘气道炎症及气道纤维化方面的作用机理，为哮喘气道重塑的发生机制提供新的思路，也为寻找防治哮喘新药开发提供有效的理论依据。

Ruxolitinib半抑制浓度 方法：将24只6-8周龄雄性小鼠随机分为4组：正常对照组、哮喘模型组、蝎黄解痉治哮颗粒小剂量组、蝎黄解痉治哮颗粒大剂量组。排除正常对照组，即将哮喘模型组、蝎黄解痉治哮颗粒小剂量组及蝎黄解痉治哮颗粒大剂量组中每只小鼠腹腔注入溶于PBS的10μgOVA和氢氧化铝混合液0.5ml处于致敏状态，并于第21天开始每天同一时间连续3天对小鼠进行激发试验，即行雾化吸入，每次30分钟制备小鼠哮喘气道炎症模型。各组小鼠均分别定时定量给予相应实验药品。记录各组小鼠BALF中的炎症细胞总数、分类及计数；肺泡灌洗液中的炎症细胞变化；肺组织病理学变化；气道上皮细胞变化；小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ含量改变；肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的表达情况。分析并对比在治疗前和治疗后各项观察结果是否有检测意义。

结果：蝎黄解痉治哮颗粒能够有效的减少哮喘气道炎症细胞及炎症因子的产生；使炎症因子IFN-γ的含量升高，IL-4、IL-5的含量下降；改善气道上皮细胞，抑制炎症的产生；阻碍肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的表达，阻挡细胞核内信号的传送。通过实验结果证实蝎黄解痉治哮颗粒可以修复受损的肺组织、减少气道炎症反应、气道纤维化及气道重塑，有效降低哮喘的复发率。 selleck化学药品 结论：蝎黄解痉治哮颗粒具有抑制哮喘小鼠磷酸化p38MAPK蛋白表达和调节Th1/Th2平衡的作用。
目的：通过P38、P42/44MAPK通路观察茵陈五苓散对高脂血症大鼠模型血脂的影响。 方法：通过高脂饲料喂饲法复制高脂血症大鼠模型,造模一月后抽样检测大鼠血脂,TG、TC、LDL-C较空白组明显升高,提示造模成功。成模的SD大鼠随机分为模型组、茵陈五苓散组(治疗组)、血脂康组(对照组),再分别灌胃茵陈五苓散药液、血脂康药液、生理盐水,同时继续高脂饲料喂饲;50天后再检测各组大鼠血脂变化,并活检大鼠肝脏组织,提取总RNA,运用QPCR分析大鼠肝脏组织LDL-R的表达；提取总蛋白,利用P38MAPK、P42/44MAPK及其磷酸化的单克隆抗体进行Western blotting分析P38MAPK、P42/44MAPK表达和磷酸化水平,同样利用P38MAPK、P42/44MAPK及其磷酸化的单克隆抗体对活检的肝脏组织切片进行免疫组化,在肝脏组织细胞中原位检测P38MAPK、P42/44MAPK表达和磷酸化水平。 结果：茵陈五苓散能够降低高脂血症模型大鼠的TC、TG及LDL-C,升高HDL-C,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01),且效果优于血脂康组(P<0.01)；也能使大鼠肝脏组织LDL-R表达明显升高(P<0.01),优于血脂康组(P<0.

采用ELISA试剂盒测定血清中CK、CK-MB、LDH、MDA及SOD含量变化。 4.采用Westenblot蛋白印迹法检测反复力竭大鼠左室心肌ERK、JNK及P38磷酸化水平。结果： 1.反复力竭游泳后大鼠血清中CK含量（ng/ml）比较：Sal-REE组（35.88±3.66）、RES组（40.61±1.80）与Control组（27.99±2.27）相比较显著升高（P＜0.05）；Sal-RES组与RES组相比升高更加显著（P＜0.05）；Sal组（27.91±1.91）与Control组相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。 2.反复力竭游泳后大鼠血清中CK-MB含量（ng/ml）比较：Sal-REE组（13.03±0.42）、RES组（14.14±0.78）与Control组（12.10±0.47）相比较显著升高（P＜0.05）；Sal-RES组与RES组相比升高更加显著（P＜0.05）；Sal组（12.23±0.63）与Control组相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。

3.反复力竭游泳后大鼠血清中LDH含量（U/L）比较：Sal-REE组（4.21±0.64）、RES组（3.31±0.66）与Control组相比较显著升高（P＜0.05）；Sal-RES组与RES组相比升高更加显著（P＜0.05）；Sal组（3.45±0.72）与Control组相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。 4.基础状态下，Control和Sal组LVDP、+LVdp/dtmax、－LVdp/dtmax无明显统计学差异（P＞0.05）；Sal-RES组和RES组分别与Control组相比，LVDP、+LVdp/dtmax、－LVdp/dtmax明显降低（P＜0.05），且RES组与Sal-RES相比明显降低（P＜0.05）。 寻找更多 I/R以后，复灌后60min时，LVDP、+LVdp/dtmax、－LVdp/dtmax恢复率Control组分别为79.15%、65.56%、66.86%；Sal组分别为78.97%、65.61%、71.84%；Sal-RES组分别为76.52%、44.35%、47.33%；RES组分别为53.22%、42.01%、31.91%。Control组和Sal组相比恢复率无明显差异（P＞0.05），Sal-RES组和RES组较Control组明显下降（P＜0.05），且RES组与Sal-RES组明显下降（P＜0.05）。 5.反复力竭游泳后大鼠血清中MDA含量（mmol/ml）比较：Sal-REE组（3.18±0.35）、RES组（3.65±0.25）与Control组（2.77±0.13）相比较显著升高（P＜0.05）；Sal-RES组与RES组相比升高更加显著（P＜0.05）；Sal组（2.84±0.31）与Control组相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。 Gefitinib细胞系 6.反复力竭游泳后大鼠血清中SOD含量(ng/ml)比较：Sal-REE组（7.56±1.00）、RES组（6.26±1.39）与Control组（9.17±0.57）相比较显著降低（P＜0.05）；RES组与Sal-RES组相比降低更加显著（P＜0.05）；Sal组（9.28±0.42）与Control组相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。

7.反复力竭游泳后，p-ERK/ERK灰度值比值Sal-REE组（1.968±0.078）、RES组（0.633±0.087）与Control组（0.202±0.037）相比较有显著升高（P＜0.05）；Sal-RES组与RES组相比升高更加显著（P＜0.05）；Sal组（0.230±0.047）与Control组（0.202±0.037）相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。 p-JNK/JNK灰度值比值RES组（1.087±0.068）与Control组（0.102±0.037）、Sal组（0.130±0.036）、Sal-REE组（0.133±0.077）相比较均有显著升高（P＜0.05）；其余三组相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。 p-P38/P38灰度值比值RES组（2.823±0.091）与Control组（0.087±0.041）、Sal组（0.179±0.074）、Sal-REE组（0.174±0.070）相比较均有显著升高（P＜0.05）；其余三组相比较无明显统计学差异（P＞0.05）结论：

1．红景天苷能够显著抑制反复力竭后大鼠血清中CK、CK-MB、LDH含量的升高，这表明红景天苷能够抑制反复力竭对大鼠心肌细胞的损伤。 2．红景天苷对反复力竭游泳大鼠具有较好的心脏保护作用，可以有效抑制缺血/再灌注所致的血流动力学改变和心功能损伤，提高离体心脏的抗缺血/再灌注能力。 3．反复力竭运动可以显著升高大鼠血清MDA含量，降低SOD含量，说明力竭性运功可能通过抗氧化应激机制造成大鼠心肌损伤及功能的下降，红景天苷的保护作用可能通过抗氧化机制发挥作用 LBH589体内 4．反复力竭运动作为应激刺激，可以显著升高ERK、JNK、P38三种激酶的磷酸化水平，表明力竭性运动可能通过MAPKS信号通路机制对大鼠心脏结构及功能造成损伤，红景天苷干预可通过升高ERK、降低JNK、P38磷酸化水平对力竭性心脏损伤起到保护作用。
薤白为百合科植物小根蒜Allium chinense GDon或Allium macrostemon Bge.干燥鳞茎,广泛分布于我国东北和华北等地,临床用于治疗心绞痛、心率不齐及腹泻等。薤白乙醇提取物中主要为皂苷类成分,具有抑制血小板聚集,降脂及抗癌等活性。 为了进一步明确薤白中皂苷类化学成分的物质基础,寻找薤白皂苷类化合物中的活性成分,本文在以下方面开展了一系列探索,主要研究成果如下： 1.对薤白皂苷类成分进行了分离和鉴定,运用UV、IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY等分析手段鉴定了其中25个成分的结构,包括1个黄酮类化合物、1个木脂素类化合物、17个已知皂苷类化合物和6个新的皂苷类化合物。 2.采用HPLC-ELSD技术建立了薤白药材甾体皂苷类成分的指纹图谱,发现其图谱中有18个共有特征峰,对12个共有峰进行了指认。采用该方法分析了来源于多个产地的11批薤白药材,并进行了相似度评价和主成分分析,为薤白皂苷类提取物质量控制提供了新方法。 3.

rDnaJ蛋白通过TLR4受体诱导小鼠BMDC成熟,与TLR2无关。5.

rDnaJ蛋白通过p38、ERK、JNK、PI3K-Akt和NF-κB等信号通路诱导小鼠BMDC成熟。6. rDnaJ蛋白通过TLR4刺激成熟的小鼠BMDC使初始CD4-T细胞向Th1和Th17细胞极化,诱导宿主产生Thl和Th17型免疫应答。结论本研究表明rDnaJ蛋白能够诱导强烈的BMDC免疫应答,该免疫应答是通过TLR4受体而不是TLR2受体、在MAPK、PI3K-Akt和NF-κB多条信号通路的参与下完成的。成熟BMDC可以使初始T细胞向Thl和Th17极化,引起宿主产生Thl和Th17型免疫应答。本研究初步阐明了肺炎链球菌DnaJ蛋白引起宿主免疫应答的机制,为肺炎链球菌DnaJ蛋白作为蛋白疫苗的研发奠定了基础。
目的：呼吸道疾病包括呼吸道感染、支气管哮喘、肺结核、肺纤维化和慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种全球性疾病,世界上有数百万人深受这类疾病的困扰。COPD导致的死亡预计到2020年将排世界第三位；全世界300百万人患有支气管哮喘,其导致的死亡人数每年达18万。人肺成纤维细胞(Human 和 pulmonary fibroblasts, HPF)不仅是肺的结构细胞,而且在肺固有免疫中扮演着重要角色。IL-32作为气道炎症中一个重要的炎症因子,促进肺部炎症发展,在肺部感染中有抵御感染的作用,在肺成纤维细胞当中的免疫学作用尚未有报道。TNF-a是气道炎症发展过程中一个关键的调节因子。研究气道炎症疾病中TNF-a调节人肺成纤维细胞表达IL-32的机制,有助于我们了解气道炎症的发展过程。方法：Q-PCR检测炎症刺激因子处理的人肺成纤维细胞中IL-32因子的mRNA表达变化；TNF-a单独或与其它因子联合处理的人肺成纤维细胞24小时后,采用ELISA检测上清中IL-32蛋白水平的变化；Western blot检测TNF-a处理的人肺成纤维细胞内信号通路蛋白JNK和Akt的磷酸化水平；采用信号通路抑制剂联合TNF-a处理的人肺成纤维细胞24小时后,采用ELISA检测上清中IL-32蛋白水平的变化。结果：TNF-a诱导可人肺成纤维细胞表达IL-32因子的四种mRNA剪接体(α、β、γ和δ)的表达增高,且具有一定的剂量依赖性。TNF-a诱导上调的IL-32蛋白主要是活性最强的IL-32γ蛋白,IL-32a蛋白并无诱导表达。与IL-17C、LPS、IFN-γ、PolyI:C、HMGB-1、Leptin和IL-27联合诱导HPF后,其IL-32y蛋白水平较TNF-a单独刺激组无显著差异,提示这些因子与TNF-a无协同作用。TNF-a激活人肺成纤维细胞后,在10分钟、20分钟时JNK和Akt的磷酸化显著增高。JNK抑制剂和Akt抑制剂联合TNF-a处理HPF组较单独TNF-a处理组的JNK和Akt的磷酸化显著降低,诱导的IL-32水平也显著下调。结论：TNF-a通过激活人肺成纤维细胞JNK和Akt信号通路诱导表达IL-32。
临床上2型糖尿病患者经常伴随高胆固醇血症。本研究利用胰岛β细胞株MIN6,考察了游离胆固醇对MIN6细胞的毒性作用。胆固醇的暴露诱导了MIN6细胞产生细胞凋亡,且这种作用方式具有时间和剂量依赖性的特点。甲基-β-环糊精的添加从细胞质膜上去除了胆固醇,并且使细胞免于胆固醇诱导的细胞凋亡。Western

Selleckchem EX527 Blot结果显示胆固醇施加后p38丝裂原活化蛋白激酶(P-p38 MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(P-JNK)的磷酸化水平显著增加,暗示应激活化蛋白激酶(SAPKs)信号通路被激活。特异性的p38抑制剂SB205830挽救了MIN6细胞免于胆固醇诱导产生的凋亡,但是JNK抑制剂SP600125没有这个效果,暗示胆固醇的施加特异性地活化了p38信号通路。内质网应激标记蛋白Bip和CHOP的表达没有受到影响,暗示在胆固醇诱导的β细胞凋亡中没有内质网应激的参与。利用活性氧荧光标记法测定细胞内活性氧(ROS)浓度的结果显示,在胆固醇施加后细胞内ROS水平显著增加,证明胆固醇诱导产生的氧化应激直接导致了细胞凋亡。综上,这些结果证明游离胆固醇通过介导氧化应激和活化p38 www.selleckchem.cn/products/kpt-330.html MAPK信号通路诱导MIN6细胞产生凋亡。
目的:5-硝基-2-3-苯丙胺苯甲酸(NPPB)属芳香族酸类非特异性氯通道阻断剂,同时其也是G蛋白偶联受体(GPCRs)家族中GPR35的激动剂,而氯离子通道与G蛋白偶联受体均与炎症有着密切的关系。近来的研究表明:炎症因子可激活血管内皮细胞氯电流,并且此电流依赖于Cl C-3氯通道的表达;而氯通道阻断剂、沉默Cl C-3氯通道蛋白以及Cl C-3基因敲除均可明显抑制内皮细胞粘附分子的表达,抑制单核细胞向内皮细胞的粘附;Cl C-3基因敲除可抑制炎症因子诱导的血管内皮细胞核转录因子-κB(NF-κB)的活化,这些均提示Cl C-3氯通道参与了炎症的过程,其调控的炎症通路可能为NF-κB信号通路。而GPR35在多种免疫细胞均有表达,与MAPK炎症通路的激活密切相关,且参与了某些炎症相关性疾病的发生,提示GPR35可能起到促进炎症的作用。NPPB兼有氯通道阻断剂和GPR35激动剂的双重作用,其在血管内炎症应答的作用机制已有较多的研究报道,而在巨噬细胞炎症应答中的作用及其机制究竟如何,目前尚未报道。因此本课题旨在探讨NPPB对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症因子的作用,并明确其作为氯通道阻断剂和GPR35激动剂对炎症因子的内在调控机制。方法:1.Western

blot和荧光定量PCR检测NPPB对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的作用;2.荧光定量PCR检测Cl C家族氯通道蛋白m RNA在巨噬细胞上的表达情况;3.免疫荧光法检测Cl C-3氯通道蛋白在巨噬细胞中的分布情况;4.si RNA沉默Cl C-3氯通道蛋白检测其对LPS诱导的巨噬细胞炎症应答的影响;5.Western blot检测其它氯通道阻断剂对LPS诱导的巨噬细胞细胞炎症因子表达的影响;6.Western blot检测NPPB对LPS诱导的巨噬细胞NF-κB、p38 MAPK、ERK、JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平的影响;7.Western blot检测GPR35激动剂对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的作用。结果:1.NPPB可上调由LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子蛋白质、m RNA的表达。2.Cl C-3氯通道蛋白在RAW264.7细胞上的表达明显高于其它Cl C氯通道亚型。3.沉默Cl C-3氯通道蛋白可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α的表达。4.不同氯通道阻断剂对LPS诱导的TNF-α表达的影响不同。5.NPPB下调LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB磷酸化水平。6.GPR35激动剂可上调LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α的表达。7.NPPB上调LPS诱导的RAW264.7细胞p38 MAPK磷酸化水平。结论:1.NPPB在基因、蛋白水平均可上调由LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.

43%,与对照比较有统计学意义;IgM的阳性率2.86%;与对照比较,无统计学意义。②ICVD患者CPn DNA的阳性率为81.08%,显著高于对照组。③当血浆标本按1:500稀释后,仍可检测到CPn0308的抗体。当用结合GST-CPn 0308的凝胶微粒(Beads)预吸附可中断反应,而用GST-CPn0186 Beads预吸附则不能中断反应,说明反应的特异性。 还有 结论:①ICVD患者CPn IgG的阳性率明显升高。②ICVD患者PBMC中CPnDNA阳性率显著升高;检出率高于EIA法,是一种敏感的检测CPn感染的检测方法。③初步分析显示CPn0308在感染人群中具有一定的免疫原性。
肝脏缺血再灌注损伤是肝脏移植中常见的问题之一,缺血再灌注引起的肝脏损伤是一个连续不断的过程,并最终导致肝细胞损伤。这个过程是在肝脏短暂缺氧并再氧合时触发,临床上许多情况下可发生肝脏缺血再灌注,例如肝脏低灌流状态,各种各样的外科手术操作,以及移植中的供体器官切取。实际上肝脏缺血再灌注损伤是抗原成分获取的结果,是影响肝脏移植结果的重要因素,引起10%左右的早期移植后器官功能衰竭,并且急性和慢性排异的发生率较高。此外,由于边缘性供体对于缺血再灌注损伤非常敏感,这加剧了供体器官的短缺。因此减少缺血再灌注损伤能明显增加获得手术成功的病人数量。然而,到目前为止仍没有可以预防缺血再灌注损伤的有效方法。所以,为了保护细胞和器官的功能,需要通过广泛的研究更好的了解肝脏缺血再灌注损伤的机制以及寻找合适的干预方法必要的。

Screening Library体内 青藤碱是从防己科防己属植物青风藤Sinomenium acutum Rehd.et Wils.根茎中分离出的主要活性成分,其结构类似于吗啡,分子式为C_(19)H_(23)NO_4,分子量为329.38,具有镇痛,抗炎等作用,临床主要用于类风湿病的治疗,疗效确切。国内外的研究表明,青藤碱具有良好的抗炎、免疫抑制作用。但是在缺血再灌注损伤中的作用却未见报道。本课题应用“二袖套”法建立大鼠原位肝移植模型,研究青藤碱在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用,并对其作用机制进行探讨。 第一部分:青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用 目的:探讨青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。方法:应用SD大鼠为模型动物;采用Kamada’s“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量(40mg/kg)和高剂量青藤碱治疗组(80mg/kg),将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,分别观察移植术后1周存活率,检测移植术后2,6,12,24h血清ALT、AST,TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(AI),RT-PCR检测肝脏组织中的TNF-α、IL-β、ICAM-1mRNA的含量,ELISA检测血清IL-2含量,并观察移植肝脏病理形态学的改变。结果:与对照组比较,青藤碱低剂量、高剂量治疗组术后1周存活率显著提高(75%,75%vs12.5%,P＜0.01),在各个时间点,青藤碱治疗组的ALT、AST水平明显低于生理盐水对照组(P＜0.01),肝组织中的TNF-α、IL-1β、ICAM-1mRNA表达与对照组相比均显著减少(P＜0.01),肝细胞凋亡指数下降,在肝移植术后24小时,生理盐水对照组的AI为37.0±4.30,而在青藤碱两治疗组分别为23.8±3.27、18.6±3.03,与对照组相比有显著差异(P＜0.01)。血清IL-2含量降低,肝细胞和肝窦内皮细胞形态也明显改善。

结论:青藤碱可以通过抑制Kupffer细胞激活及释放TNF-α、IL-1β等炎症性细胞因子及ICAM-1等粘附分子,抑制肝细胞凋亡,减少细胞免疫相关IL-2的分泌,减轻肝细胞及肝窦内皮细胞的损伤,达到保护肝移植缺血再灌注损伤的效果。 和 第二部分青藤碱对大鼠肝移植缺血再灌注后TLR4、MAPKs和NF-κB表达的影响 目的:通过观察不同剂量的青藤碱对大鼠肝移植术后TLR4、MAPKs和NF-κB的影响,探讨青藤碱保护大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制。方法:应用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、对照组、低剂量(40mg/kg)和高剂量青藤碱治疗组(80mg/kg),将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,选择缺血再灌注后大鼠肝功能损伤最严重的术后6小时为观察点。采用Western Blot方法检测大鼠肝脏组织的TLR4、磷酸化JNK、ERK、p38 MAPK和NF-κB蛋白表达的变化情况。结果:在假手术组TLR4呈低表达,生理盐水对照组TLR4呈高表达,青藤碱显著降低了肝组织TLR4的表达(P＜0.01)。磷酸化JNK、ERK在各组的表达比较无明显差异。磷酸化p38 MAPK和NF-κB在假手术组呈低表达,在生理盐水对照组高表达,而青藤碱明显抑制了磷酸化p38 MAPK和NF-κB的表达(P＜0.

5μmol/kg组，盐酸双苯氟嗪1.3μmol/kg组，盐酸双苯氟嗪0.7μmol/kg，氟桂利嗪（Flu）1.3μmol/kg组。采用线栓法制备大鼠局灶性缺血再灌注模型，各组在缺血再灌注的同时尾静脉注射给药，给药容积为0.2ml/100g。假手术组只行手术通路，不插线栓不给药。缺血2h再灌4h后测定神经症状、脑含水量、血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，采用HE染色法光镜下观察组织病理变化，采用免疫组织化学染色法检测AQP-4蛋白的表达，以评价盐酸双苯氟嗪对缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。 SB431542临床试验 结果：（1）神经功能评价结果显示，假手术组大鼠未产生神经功能损伤，溶剂组大鼠神经功能评分为9.50±0.22，有明显损伤（P＜0.01）。盐酸双苯氟嗪大、中剂量组和Flu组与溶剂组相比有明显下降（P＜0.01），大鼠神经功能评分分别降至6.50±0.96、7.33±0.94和7.66±0.42。（2）脑

含水量测定结果显示，缺血再灌注损伤后脑组织含水量明显升高至82.24±0.23%，药物干预后，盐酸双苯氟嗪各剂量组与Flu组大鼠脑含水 量有明显降低，分别为大剂量组78.96±0.95%、中剂量组79.95±0.47%、小剂量组81.08±0.40和Flu组79.41±0.65%，抗脑水肿效果明显。（3）血清中SOD活性与MDA含量测定结果显示，缺血再灌注损伤后血清中SOD活性明显下降至24.86±0.86U/ml，MDA含量明显升高至6.11±0.05nm/ml，给予盐酸双苯氟嗪干预后，可减轻以上损伤，其中大剂量盐酸双苯氟嗪作用最为明显，SOD活性提高至61.79±1.09U/ml，MDA含量下降为4.64±0.05nm/ml。（4）HE染色结果显示，假手术组大鼠神经细胞未见明显病变。溶剂组大鼠缺血侧大脑皮层、纹状体和海马区出现严重的神经细胞变性坏死，胞体固缩，核浓缩深染，细胞与周围组织形成明显的间隙，出现空泡变性。高中低三个剂量的盐酸双苯氟嗪可以剂量依赖性明显改善上述病变。（5）免疫组化检测AQP-4蛋白表达结果显示，AQP4主要在血管周围的胶质细胞有阳性表达，表达部位为细胞膜。假手术组胶质细胞仅有少量AQP-4的表达，缺血再灌注以后梗死周边区域AQP-4的表达则明显增多。盐酸双苯氟嗪大剂量组（4.60±0.31）、盐酸双苯氟嗪中剂量组（6.10±0.37）以及Flu组（5.70±0.47）胶质细胞的AQP-4表达与溶剂组相比均有显著减少（P＜0.01）。

结论：盐酸双苯氟嗪能够通过清除自由基、抗脂质过氧化及减少梗死周边区域AQP-4的表达而减轻脑水肿程度，发挥神经保护作用。 目的：评价盐酸双苯氟嗪在糖氧剥夺/复氧所致海马神经元损伤中的保护作用以及机制研究 方法：体外培养原代海马神经元，7-8天成熟后，细胞随机分为I2h-R24h组、I4h-R24h组、I6h-R24h组、I8h-R24h组，通过MTT比色法测定细胞存活率，确定使用I6h-R24h作为糖氧剥夺/复氧模型。经I6h-R24h损伤后的细胞随机分为空白对照组、溶剂对照组、盐酸双苯氟嗪10μmol/L组、盐酸双苯氟嗪1μmol/L组、盐酸双苯氟嗪0.1μmol/L组和氟桂利嗪（Flu）1μmol/L组。分别测定各组神经元细胞MTT 许多 OD值、LDH漏出、胞内钙离子浓度、NO含量、NOS活性、细胞凋亡率，以评价盐酸双苯氟嗪的保护作用并研究其机制。 结果：（1）经不同浓度盐酸双苯氟嗪干预的细胞，MTT测定的OD值明显增高，显示细胞活性升高，LDH漏出显著降低，表示细胞受损程度减小。（2）糖氧剥夺/复氧可致海马神经元胞浆内钙离子超载，盐酸双苯氟嗪可减轻由糖氧剥夺/复氧所致的海马神经元钙超载，其中高浓度组（238.50±7.73）与溶剂组(319.40±10.79)相比有显著性差异（P＜0.01）。（3）糖氧剥夺/复氧损伤会使细胞NO含量与NOS活性都明显升高，不同浓度的盐酸双苯氟嗪与Flu能够不同程度的改善此种损伤变化。（4）原位凋亡实验结果显示，正常对照组细胞可见有少量凋亡细胞（41.30±1.78），糖氧剥夺/复氧损伤使凋亡细胞数目明显增多（152.20±2.29，P＜0.01），盐酸双苯氟嗪可降低凋亡细胞数目，其中高浓度组（60.70±1.61）和中浓度组（100.10±1.94）与溶剂组相比有显著性差异（P＜0.01）。

Bcl-2 phosphorylation 结论：盐酸双苯氟嗪可能通过阻断糖氧剥夺/复氧所致海马神经元胞浆内游离钙离子浓度， NO含量以及NOS活性的升高，改善糖氧剥夺/复氧引起的海马神经元损伤，发挥抗凋亡的作用。
目的：对融合蛋白d-EGF二级、三级结构进行预测并分析其活性部位的可能影响，进行原核表达，并对表达产物进行分析鉴定。方法：以融合蛋白质基因序列为基础，用DNAStar软件预测其蛋白质的二级结构；用Insight II软件对其三级结构进行建模预测。在对融合蛋白理论预测的基础上，分别构建含β-defensin-3、EGF的重组质粒，应用重组PCR等方法，将EGF的基因序列融合到β-defensin-3DNA序列的3’末端，将融合基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建目的重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法对目的基因是否正确重组进行鉴定；以重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），以IPTG诱导表达目的蛋白质，表达产物经过Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达初产物及纯化产物。最后用Western-blot对其特异性进行鉴定；用MTT法检测其促细胞增殖活性；用纸片扩散法药物敏感试验、微量稀释法检测其抗菌活性。结果：采用DNAStar软件的Gamier Robson方法预测的结果表明，融合蛋白质d-EGF含较多的β折叠结构；Charge Density-Charge法预测蛋白质3-22、31-48区段带丰富的正电荷；Insight II软件分析显示重组蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三级结构中的活性必须的六个链内二硫键在融合蛋白中都能够正确形成，维持β-defensin-3三级结构的3个反向平行的β折叠片结构在融合蛋白中能够形成。融合蛋白的结构含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性结构。成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。转入重组质粒的E.

61±0.57%和2±0.22%。通过CFCs (cloning forming cells)检测发现Rapamycin对于粒-巨细胞形成集落,爆式红细胞集落的生成没有显著的影响。对衰老表型的研究发现,在未扩增的对照的细胞中,我们几乎没有发现衰老的细胞,细胞在Veh的处理下,扩增了10天以后,Lin-Sca-1+细胞出现了9.7±1.95%的衰老细胞,但是Rapamycin非常明显的抑制了衰老细胞出现的频率,为2.4±0.71%。对自噬的研究发现,经过Rapamycin处理以后,自噬标志性分子LC3b的表达面积显著低于Veh组,甚至比未扩增的细胞还要低；对细胞周期的研究发现,Rapamycin处理显著的增加了G0期细胞的比例,Veh组的G0期细胞的比例为11.75±3.3%,Rapamycin组的G0期细胞的比例为21.7±3.5%。不仅如此,Rapamycin的处理还减低了p16和p53的表达。 Pazopanib 结论：抑制mTORCl活性并没有影响造血干细胞的凋亡和分化,而显著降低了其在扩增过程中出现的衰老。Rapamycin并没有通过增强自噬来抑制衰老,而是通过调节了一系列的细胞周期动力因子和阻滞因子实现了对衰老的抑制。

第四部分mTORCl和p38 MAPKα在造血干细胞体外扩增过程中的相互对话关系 目的：在我们以前的研究中发现了抑制p38 MPKα的活性可以通过抑制衰老促进造血干细胞的体外扩增,而在这里我们发现了抑制mTORCl的活性也是主要通过抑制衰老的作用而促进了造血干细胞的体外扩增,那么两者的关系究竟如何呢?在这部分的研究当中我们对mTORCl和p38 MAPKα相互对话关系进行了深入的探讨和研究。 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞,应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞,应用Rapamycin作为mTORCl抑制剂,SB(SB203580)作为p38 MAPKα的抑制剂,以DMSO作为对照。扩增10天,SB从第一天开始加,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集扩增后细胞。通过免疫印迹,免疫荧光,聚合酶链式反应等方法检测相关分子表达情况。 结果：在造血干细胞体外扩增过程当中,抑制mTORCl对p38 MAPKα没有影响,但是抑制p38

MAPKα活性会反而增强mTORCl的活性。联合抑制mTORCl和p38 MAPKα可以进一步促进造血干细胞的体外扩增。四组比较发现,Veh组获得了1.5±0.3×103,Rapamycin组获得了1.9±0.1×103,SB组获得了2.2±0.2×103,联合处理组获得了2.6±0.14×103的LSK+细胞,以及更多的day35 CAFCs,分别为3.4±0.57,7.8±0.32,9.7±0.21,11.4±0.63/100,000个扩增细胞。联合抑制mTORCl和p38 MAPKα,通过对SA-β-gal的研究发现SB和Rapamycin的联合应用明显的进一步降低了衰老表型的表达,只有1.9±0.7%,而单独加入Rapamycin或者SB则有4.3±2.1%,5.2±1.6%,联合抑制以后p16和p53的表达进一步降低,只有Veh组的0.37±0.05,0.45±0.08倍。 结论：在造血干细胞过程中抑制mTORCl对p38 没有 MAPK a活性没有影响,而抑制p38 MAPKα活性会进一步激活mTORCl,同时抑制两条通路可以通过增强抑制衰老达到进一步促进造血干细胞扩增的目的。
疾病的发生发展几乎总是引起不同程度的疼痛发生。尽管已有多种药物和方法可用来进行疼痛治疗,但其效果并不理想。因此寻求新的疼痛调节因子并进行干预治疗具有重要的临床意义。伤害性刺激或神经损伤诱导的炎症免疫反应与疼痛发生发展关系密切。MIF是参与几乎所有炎症性疾病过程的促炎性细胞因子,有研究提示MIF是神经损伤后再生与功能恢复的重要参与者。鉴于神经损伤与疼痛之间的因果联系,推测MIF可能在疼痛发生发展过程起着敏化神经及降低痛阈的作用。

Alisertib化学结构 本研究通过建立急性炎症性疼痛和慢性神经病理性疼痛模型,鞘内给药MIF互变异构酶小分子抑制剂ISO-1观察疼痛阈值变化与脊髓MIF水平之间的关系,进而分析MIF介导疼痛病理发生的可能信号活化机制。这为疼痛治疗潜在干预靶点提供线索,并为MIF相关疼痛药物的开发提供理论基础。整个研究分为如下三个部分： 一.MIF参与福尔马林诱导急性炎症性疼痛阈值的调节及其机制 通过福尔马林诱导炎症性疼痛模型大鼠鞘内给药不同剂量MIF小分子抑制剂ISO-1,发现福尔马林诱导的二相疼痛行为学改善呈现ISO-1剂量依赖性变化。伴随着福尔马林诱导疼痛行为学变化,大鼠脊髓背角MIF及其受体CD74蛋白表达呈现时间依赖性上调特征；同时脑脊液MIF水平在福尔马林注射后第二时相后期显著增加；而ISO-1的应用使得脊髓背角MIF及CD74表达下调,这说明脊髓MIF水平的变化参与福尔马林诱导炎症性疼痛的发生发展。在此基础上,应用蛋白印迹技术发现ISO-1可以显·著抑制ERK、p-p38 MAPK及NR2B表达；而ERK与p38 MAPK抑制剂又可显著下调NR2B蛋白表达,这说明ERK-p38 MAPK-NR2B信号通路的活化参与了MIF介导福尔马林诱导炎症性疼痛的病理发生过程。进一步地,通过免疫组化方法检测了脊髓背角MIF、CD11b、CD3的表达变化,结果发现MIF与CD11b共表达于脊髓背角,这说明福尔马林诱导炎症性疼痛大鼠脊髓背角MIF高表达来源于脊髓小胶质细胞。为了证明抑制MIF互变异构酶活性与抑制其生物活性等效,即鞘内ISO-1的应用是否有效抑制MIF生物活性,本研究以多巴铬甲酯为互变异构酶活性检测工具,进行了MIF互变异构酶活性与MIF生成之间的相关性观察,结果显示ISO-1抑制MIF互变异构酶活性的作用与抑制MIF生成的作用一致,从而证明选择MIF互变异构酶小分子抑制剂作为MIF相关性疼痛治疗与药物开发切实可行。 二.

角膜缝线法建立SD大鼠角膜新生血管模型建立大鼠右眼新生血管模型,在大鼠角膜缘内1mm等间距缝合3针,深及基质层。选取未缝线的正常角膜作为阴性对照组,并将缝线后大鼠随机分为缝线后第1日组,第3日组以及第7日组,每组8只。

2.显微镜下观察角膜缝线后每日在手术显微镜下观察,均放大16倍,注意角膜透明度、上皮完整性、缝线数量以及是否存在角膜感染。 点击此处 3.计算角膜新生血管面积计算角膜缝线后第1日、第3日以及第7日,分别在显微镜下测量角膜新生血管长度,并依据Robert公式计算角膜新生血管面积。 4. Western Blot检测缝线后角膜血管化进程中p38和磷酸化p38的表达缝线当日以及缝线后第1、3、7日,分别从各组随机选取5只大鼠,摘取角膜,收集角膜蛋白,采用Western Blot方法检测各组角膜p38以及磷酸化p38的表达,并检测目的蛋白IOD与内参GAPDH的IOD,二者比值作为目的蛋白的相对表达量。 5.免疫荧光检测p38和磷酸化p38在角膜上的表达按照分组分别在特定时间摘取角膜,采用免疫荧光的方法检测p38和磷酸化p38在角膜的表达以及定位。 6.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示。当方差齐性时,采用one-way ANOVA分析；方差不齐时采用Welch法校正。组间比较,当方差齐性时,采用LSD分析；当方差不齐性时,采用Dunnett T3进行分析。所有统计推断均采用双侧检验,检验水准α=0.05。 结果 1.显微镜下观察缝线后7d,角膜缘血管网充血,缝线处角膜水肿增厚,并随时间延长逐渐加重,缝线后3d,睫状充血明显,角膜缝线处角膜缘明显局限性充血,可见新生血管缓慢长入,每处约2-5支,缝线处角膜未见明显混浊,全角膜透明；缝线后7d,见大量新生血管长入透明角膜,新生血管呈密集网状,无法计数,部分新生血管长到缝线处,缝线处角膜轻度混浊并增厚。

2.角膜新生血管面积缝线后第1日,未发现新生血管；缝线后3、7d,角膜新生血管面积分别为4.1-1.22、7.26±0.72mm2；而正常角膜无新生血管。 Screening Library花费 3.Western Blot结果 各组角膜p38的相对表达量为：正常角膜组0.5681±0.1074,缝线后第1日组为0.5512±0.0795,第3日组为0.5517±0.0908,第7日组为0.5641±0.1168；不同实验组间p38的表达量无显著性差异(F=0.037,P=0.990)。 各组角膜磷酸化p38的相对表达量为：正常角膜组0.2969±0.0475,缝线后第1日组0.6219±0.0609,第3日组0.2812±0.0602,第7日组为0.3149±0.0496；不同组之间磷酸化p38相对表达量有显著性差异(F=43.895,P=0.000)；以缝线后第1日最高,缝线后第3、7日次之；而正常角膜与缝线后第3、7日无显著性差异。 4.免疫荧光结果各组p38表达基本一致,主要分布在炎性浸润细胞,新生血管内皮细胞以及部分上皮细胞,主要定位于细胞浆；而磷酸化p38表达在炎性细胞、新生血管内皮细胞,主要定位于细胞核,在缝线后第1日高表达。

www.selleckchem.cn/products/VX-809.html 结论 1.在大鼠角膜血管化进程中,p38表达基本恒定；而磷酸化p38在缝线后第1日,即出现高峰表达,而后迅速衰减,至缝线后第3、7日已基本恢复至正常。 2.大鼠角膜缝线后,早期即有p38信号通路的强激活,而后逐渐出现可观察到的角膜新生血管。 3.缝线后大鼠角膜新生血管化可能与p38信号传导通路激活相关。 4.p38信号传导通路的早期激活可能是缝线后角膜新生血管生长的始动因素之一。 第二部分结膜下注射50μmol/L p38信号传导通路抑制剂SB203580对大鼠角膜的毒性作用 目的 研究结膜下注射SB203580对大鼠角膜的毒性作用,探索结膜下注射SB203580的合适浓度,探讨结膜下注射SB203580用于阻断p38信号传导通路的可能性,为后续实验奠定基础。 方法 1.配置50μmol/L SB203580溶液取0.05mL预冷的二甲基亚砜加入1mgSB203580中,振荡,然后加入预冷的生理盐水53.00mL,充分振荡混匀。按每支1mL分装于无菌冻存管中,-20℃冻存备用。 2.实验分组SD大鼠适应性饲养1周,裂隙灯显微镜检查排除大鼠结膜、角膜疾病后,随机分为50μmol/L SB203580组和生理盐水组,每组10只。 3.结膜下注射均选右眼进行实验,在角膜缘外0.5～1.0mm,沿顺时针方向,在12,2,4,6,8,10,12点位注射,依次每日选取1个注射点,每日1次行结膜下注射,共7d。按照实验分组分别注射50μmol/L SB203580和生理盐水0.04mL。 4.实验观察以及角膜炎症指数评分在裂隙灯显微镜下观察注射点结膜充血情况、角膜透明情况以及上皮是否完整等。结膜下注射7d后,在裂隙灯下观察中央角膜水肿程度、周边角膜水肿程度以及睫状充血程度行角膜炎症指数评分。 5.组织学及透射电镜观察结膜下注射7d后,摘取角膜,沿中心线剖切一分为二。一半用40g/L多聚甲醛固定,常规制作石蜡切片,苏木精-伊红染色观察组织学改变；另一半迅速用预冷的25g/L戊二醛固定,常规丙酮梯度脱水、渗透、包埋,超薄切片,醋酸铀及柠檬酸铅双重染色,透射电镜观察。 6.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用T检验,所有统计推断均采用双侧检验,检验水准a=0.05。 结果 1.动物观察裂隙灯显微镜下观察发现SB203580注射部位结膜呈可逆性贫血状改变,注射次日即消失；在注射过程中,连续观察见角膜始终透明,上皮层无水肿、无剥脱。 2.在连续结膜下注射SB203580或生理盐水7d后,两组大鼠角膜炎症指数分别为：0.14±0.07,0.21±0.10,两组间炎症指数无显著性差异(t=1.716,P=0.103)；其中两组睫状充血程度评分分别为：0.70±0.48和1.30±0.67,生理盐水组睫状充血程度评分显著高于SB203580组(t=2.286,P=0.035)。 3.

05)；第十二周后,PPS组CD4+CD3+的T淋巴细胞的百分率显著升高(P<0.05),不同剂量猪苓组CD28+表达均升高,其中中剂量组升高显著(P<0.05)。(P<0.05)。PPS组TCRγδ+的T淋巴细胞的百分率(均值)同模型组显著升高(P0.05)。中、高剂量猪苓组TLR4／CD14的表达百分率与模型组比较则显著降低(P<0.05)；模型组腹腔巨噬细胞NO释放的比值LPS(+)／LPS(-)与空白对照组比较明显升高(P<0.05),而PPS组与模型组比较则显著降低(P<0.05),不同浓度猪苓组与模型组比较NO释放的比值均显著显著降低(P<0.05)。PPS组TLR4mRNA的表达水平明显升高,低剂量、中剂量和高剂量猪苓组TLR4mRNA的表达水平均升高,其中高剂量猪苓组TLR4mRNA的表达水平与模型组比较有显著差异(P0.05)。PPS协同BCG组巨噬细胞表面CD86、CD40的表达与模型组比较均显著升高(P0.05)。BCG组腹腔巨噬细胞TLR4／CD14的表达显著升高(P<0.05)。BCG联合PPS明显低于单独BCG组。BCG组NO释放的比值LPS(+)／LPS(-)与模型组比较无显著性差异；均较空白对照组显著升高；BCG联合PPS组及BCG联合猪苓组与模型组比较NO释放的比值均显著降低(P
硒是具有抗癌作用的人体必需微量元素之一,大量证据表明,超营养剂量的硒能够诱导前列腺癌、肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞的凋亡。在本实验室的前期工作中已经发现,20μM亚硒酸钠(sodium

点击此处 selenite)能够诱导人急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)细胞株NB4发生显著凋亡,活性氧(active oxygen species, ROS)是关键的上游调控因素。亚硒酸钠刺激NB4细胞迅速产生大量活性氧,通过活性氧启动线粒体凋亡通路与内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)凋亡通路。为了详细阐明NB4细胞在亚硒酸钠诱导凋亡的过程中发生的分子生物学变化,我们仍然需要进行更深入的探索。 本研究在前期工作的基础上,进一步探讨了在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中,一些受到活性氧调节的重要分子的变化情况、调节通路及其对凋亡的意义,重点对关键抗氧化酶MnSOD(manganese superoxide 以及 dismutase)进行了研究。经Western bolt发现,亚硒酸钠在诱导NB4细胞凋亡的同时引起了MnSOD的显著上调,活性氧清除剂MnTMPyP完全阻断该上调效应,提示活性氧是其上游调控因素。经不同活性氧探针检测发现,亚硒酸钠作用后诱导两种细胞内活性氧超氧自由基(superoxide radical)与过氧化氢(hydrogen peroxide)迅速而显著的升高,其中超氧自由基可能对于MnSOD的上调起主要作用。就具体通路而言,蛋白激酶ERK(extracellular signal-regulated kinase)与转录因子p53是活性氧介导MnSOD上调的关键因素。cDNA测序结果证明本研究使用的NB4细胞表达野生型的p53。经Western blot检测核蛋白提取物和免疫荧光染色发现,亚硒酸钠诱导细胞产生活性氧后,活性氧促使ERK2从胞质转位至核内,磷酸化p53的关键位点Ser15。免疫共沉淀结果显示,ERK2在核内通过直接作用的方式磷酸化p53。采用该方法还发现,在未经亚硒酸钠作用的NB4细胞的核内,p53与其抑制性蛋白MDM2(mouse

double minute 2)处于结合状态,而经亚硒酸钠处理后,核内p53被ERK磷酸化,从而与MDM2解离而被激活。采取p53选择性抑制剂Pifithrin-α(PFT)抑制其转录活性,或通过siRNA干扰降低其表达,均能显著抑制亚硒酸钠诱导的MnSOD上调,提示p53作为MnSOD的上游转录因子诱导了其表达。对于p53缺失或突变的白血病细胞株HL-60或U937,亚硒酸钠不能诱导MnSOD上调,进一步证明了p53的重要作用。通过上述研究阐明了亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中,细胞内存在一条ROS-ERK-p53-MnSOD信号通路,该通路可能是NB4细胞在面临氧化应激时启动的重要抗氧化机制。 前期研究已经发现,在未经亚硒酸钠处理的NB4细胞中存在活跃的自噬作用,亚硒酸钠处理后,在诱导凋亡的同时伴有自噬的减弱。本研究在此基础上进行了进一步探讨,发现p53的激活除了诱导MnSOD上调,还是亚硒酸钠促进NB4细胞由自噬转向凋亡的关键因素。Western blot和免疫共沉淀结果显示,亚硒酸钠通过蛋白激酶ERK和p38MAPK引起p53关键位点Ser15的磷酸化,进而导致p53与其抑制性蛋白MDM2解离并被激活。借助免疫荧光染色与免疫共沉淀发现,在此过程中核仁蛋白B23从核仁转位至核质,与MDM2共定位并发生相互作用,从而起到稳定p53的作用。采用p53抑制剂PFT抑制其活性或通过siRNA干扰降低其表达,均能显著逆转亚硒酸钠诱导的凋亡、caspases激活以及自噬标志分子Beclin-1和LC-3的表达下调,表明激活后的p53一方面促进凋亡的进行,另一方面抑制自噬,从而在NB4细胞由自噬转向凋亡的过程中扮演关键角色。 selleck激酶抑制剂 本研究还发现,在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡后期,蛋白激酶PKCalpha(protein kinase Calpha)在蛋白水平与磷酸化水平均显著下调,其下调同样由活性氧所介导。采用PKCalpha抑制剂与siRNA干扰发现,PKCalpha在NB4细胞中发挥抗凋亡作用,并且该作用建立在其对蛋白激酶ERK与Akt调节的基础之上,活性氧探针检测发现,PKCalpha还具有抑制活性氧产生的作用。此外,活性氧还激活了蛋白水解酶caspase-3,诱导磷酸酶PP2Ac的表达,在凋亡后期,活性氧通过caspase-3与PP2Ac分别在蛋白水平与磷酸化水平下调PKCalpha,从而加速了凋亡的进行。因此,下调抗凋亡激酶PKCalpha可能是亚硒酸钠在凋亡后期维持并促进凋亡的重要机制之一。 细胞色素C氧化酶亚基IV(cytochrome c oxidase subunit IV, COX IV)是线粒体呼吸链的重要组分,在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡后期,该蛋白同样受到活性氧的显著下调,RT-PCR显示其mRNA水平没有明显变化,提示非转录机制参与其下调。进一步研究发现,活性氧通过激活caspase-3介导COX IV的下调。采用shRNA表达载体抑制COX IV的表达,能够显著增强亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡,表明亚硒酸钠可能通过ROS-caspase-3-COX IV这一途径损伤线粒体呼吸链,加速凋亡的进行。
蛋白激酶(protein kinase,PK)是细胞内最大的蛋白家族之一,在真核细胞信号转导中扮演重要的角色。蛋白激酶是一类磷酸转移酶,其作用是将ATP分子的γ磷酸基转移到底物蛋白特定的氨基酸残基上,使底物蛋白磷酸化。人类基因组内共含有518个蛋白激酶基因,约占真核生物基因的1.

2倍,E6使细胞的运动活性增加1.8倍。在集落形成抑制实验中信号蛋白抑制剂PD98059能够完全抑制变异体RON△160介导导的集落形成。 结论: 一.抗-RON单克隆抗体G9和E6对RON受体具有高度的亲和性并且能够与受体的胞外域特异结合而使RON受体及其下游信号蛋白磷酸化;能够显著增加RON△160介导的致瘤活性,包括:诱导细胞形态改变,集落形成及运动活性增加,具有良好的配体模拟样作用,是配体MSP的有效替代者,也是我们研究变异体RON△160致瘤机制的又一有力工具。 二.RON受体酪氨酸激酶及其下游Erk1/2MAPK信号通路可能在RON及其变异体介导的致瘤活性中具有重要作用。
谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质,在神经发育、突触传递、突触可塑性、学习、记忆等一系列脑功能活动中发挥重要作用。而过量谷氨酸可引起NMDA受体的过度活化并诱导神经元死亡,该作用被称为兴奋性神经毒(excitotoxicity)。兴奋毒在许多急慢性疾病中发挥重要作用包括神经退行性疾病、不同原因造成的神经损伤包括缺血/再灌的损伤。根据谷氨酸作用的相对强度和持续时间不同,兴奋毒引起的损伤可能存在坏死或凋亡等不同的细胞死亡形式。坏死性凋亡是新近发现的一种细胞死亡方式,由于兼具坏死及凋亡的特征因此得名,包括出现坏死的形态特征及某些凋亡的信号通路同时伴随自噬的活化。Necrostatin-1(Nec-1)是一种特异且有效的抑制坏死性凋亡的小分子物质,可用来鉴定在神经损伤中是否存在坏死性凋亡的途径。迄今为止,坏死性凋亡的机制并不清楚,Nec-1的发现为评价坏死性凋亡的特征及作用提供了唯一的可能。本研究利用Nec-1作为工具药,通过观察Nec-1对NMDA诱导的兴奋毒的抑制作用,从而明确NMDA诱导的兴奋毒中是否存在坏死性凋亡以及钙超载在其中的作用。实验中通过检测细胞活力、LDH释放及Calcein-AM染色观察NMDA的毒性作用及证实Nec-1的抑制作用,通过激光共聚焦检测NMDA引起的胞内Ca~(2+)升高及Nec-1的作用,证实Ca~(2+)超载在坏死性凋亡的作用。

哪里 结果显示:1. Nec-1抑制NMDA引起的细胞活力的降低。换句话也就是说Nec-1预处理引起细胞活力的增加,并呈剂量依赖性。Nec-1(30μmol/L)和Nec-1(100μmol/L)分别使其增加12%(p 并且 < 0.05)和26%(p < 0.01),但Nec-1(10μmol/L)并不能抑制NMDA引起的细胞活力的降低。 2. Nec-1抑制NMDA引起的活细胞数的减少。Nec-1(30μmol/L)和Nec-1(100μmol/L)分别使活细胞数增加11%(p < 0.05)和23%(p < 0.01)。 3. Nec-1抑制NMDA引起的LDH释放的增加。Nec-1(30μmol/L)和Nec-1(100μmol/L)分别使LDH释放减少14%(p < 0.05)和28%(p < 0.01)。 4. Nec-1抑制NMDA引起的胞内Ca~(2+)的升高。Nec-1(100μmol/L)使NMDA诱导的胞内Ca~(2+)的升高降低36%(p

< 0.05)。 上述结果表明,除坏死和凋亡外,坏死性凋亡也参与兴奋性神经毒的病理过程。由于NMDA引起兴奋毒在多种损伤中发挥重要作用,因此预防和治疗兴奋毒对预防和治疗神经损伤有至关重要的意义。由于坏死性凋亡具有可调控的特征,因此提供了一个更有意义的预防治疗兴奋性神经毒的靶点。结论:1.坏死性凋亡参与NMDA诱导的兴奋毒;2.胞内Ca~(2+)升高可能是坏死性凋亡发生的机制之一;3.尽管坏死性凋亡在NMDA诱导的兴奋毒中起作用,但其作用可能仅占其中一小部分。
目的建立同步观察行为学和脑电波变化的槐定碱致痫大鼠癫痫模型,观察清醒状态下槐定碱致痫大鼠行为学和脑电波的变化;探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated LY294002购买 protein kinase,MAPK)信号转导通路中的主要成员细胞外信号调节蛋白激酶ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2)通路及其活化形式—磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在槐定碱致痫大鼠海马细胞的表达变化规律及其意义,进而探讨该通路在癫痫发病机制中的作用。 方法①Sprague Dawley大鼠随机分为生理盐水对照组和槐定碱致痫组,通过脑立体定位仪将自制埋藏电极植入大鼠海马一周后,腹腔注射槐定碱(sophoridine,SRI)建立急性化学点燃癫痫大鼠模型,对其行为学和脑电图上的痫性放电进行同步观察。②S D大鼠随机分为生理盐水对照组、槐定碱致痫组、苯巴比妥钠(phenobarbital sodium,PBS)﹢槐定碱组和PD98059﹢槐定碱组,应用免疫组化染色方法检测各组大鼠致痫后0.5h、1.5h、5.0h、8.0h海马CA1区和CA3区ERK1、ERK2和p-ERK1/2的免疫阳性神经元数量的变化和应用Western blot方法进一步检测各组大鼠各时间点海马该三种蛋白表达规律;同时采用HE染色方法和电镜技术观察海马CA1区和CA3区神经元组织病理学和形态学的改变。 结果 1.行为学及大鼠清醒脑电图表现 槐定碱致痫组大鼠腹腔注射槐定碱后,大鼠由活动状态逐渐变得安静,随后出现呆滞,部分动物出现呼吸急促,经8.46±1.62min的潜伏期后,大鼠逐渐出现癫痫样发作表现。开始出现须动、点头、咀嚼样动作,尾巴翘起,湿狗样抖动,伴流涎,至0.5h左右开始有面肌抽动、双前肢抬起阵挛或单肢抽搐,随后出现姿势失衡,跌倒,阵挛抽搐,继之发生全身强直,持续36.84±5.69min,点燃率达100﹪,达到Ⅳ级以上发作的成功率为80%,死亡率为20%。在大鼠痫性发作的同时脑电图出现频发性尖波单棘波,棘波、棘慢波,发作性节律波等癫痫样放电。生理盐水对照组大鼠脑电图均为基础波,且无癫痫样放电。槐定碱致痫大鼠癫痫发作过程中伴有与行为相一致的清醒脑电图改变。 2.