5μmol/kg组，盐酸双苯氟嗪1.3μmol/kg组，盐酸双苯氟嗪0.7μmol/kg，氟桂利嗪（Flu）1.3μmol/kg组。采用线栓法制备大鼠局灶性缺血再灌注模型，各组在缺血再灌注的同时尾静脉注射给药，给药容积为0.2ml/100g。假手术组只行手术通路，不插线栓不给药。缺血2h再灌4h后测定神经症状、脑含水量、血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，采用HE染色法光镜下观察组织病理变化，采用免疫组织化学染色法检测AQP-4蛋白的表达，以评价盐酸双苯氟嗪对缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。 SB431542临床试验 结果：（1）神经功能评价结果显示，假手术组大鼠未产生神经功能损伤，溶剂组大鼠神经功能评分为9.50±0.22，有明显损伤（P＜0.01）。盐酸双苯氟嗪大、中剂量组和Flu组与溶剂组相比有明显下降（P＜0.01），大鼠神经功能评分分别降至6.50±0.96、7.33±0.94和7.66±0.42。（2）脑
含水量测定结果显示，缺血再灌注损伤后脑组织含水量明显升高至82.24±0.23%，药物干预后，盐酸双苯氟嗪各剂量组与Flu组大鼠脑含水 量有明显降低，分别为大剂量组78.96±0.95%、中剂量组79.95±0.47%、小剂量组81.08±0.40和Flu组79.41±0.65%，抗脑水肿效果明显。（3）血清中SOD活性与MDA含量测定结果显示，缺血再灌注损伤后血清中SOD活性明显下降至24.86±0.86U/ml，MDA含量明显升高至6.11±0.05nm/ml，给予盐酸双苯氟嗪干预后，可减轻以上损伤，其中大剂量盐酸双苯氟嗪作用最为明显，SOD活性提高至61.79±1.09U/ml，MDA含量下降为4.64±0.05nm/ml。（4）HE染色结果显示，假手术组大鼠神经细胞未见明显病变。溶剂组大鼠缺血侧大脑皮层、纹状体和海马区出现严重的神经细胞变性坏死，胞体固缩，核浓缩深染，细胞与周围组织形成明显的间隙，出现空泡变性。高中低三个剂量的盐酸双苯氟嗪可以剂量依赖性明显改善上述病变。（5）免疫组化检测AQP-4蛋白表达结果显示，AQP4主要在血管周围的胶质细胞有阳性表达，表达部位为细胞膜。假手术组胶质细胞仅有少量AQP-4的表达，缺血再灌注以后梗死周边区域AQP-4的表达则明显增多。盐酸双苯氟嗪大剂量组（4.60±0.31）、盐酸双苯氟嗪中剂量组（6.10±0.37）以及Flu组（5.70±0.47）胶质细胞的AQP-4表达与溶剂组相比均有显著减少（P＜0.01）。
结论：盐酸双苯氟嗪能够通过清除自由基、抗脂质过氧化及减少梗死周边区域AQP-4的表达而减轻脑水肿程度，发挥神经保护作用。 目的：评价盐酸双苯氟嗪在糖氧剥夺/复氧所致海马神经元损伤中的保护作用以及机制研究 方法：体外培养原代海马神经元，7-8天成熟后，细胞随机分为I2h-R24h组、I4h-R24h组、I6h-R24h组、I8h-R24h组，通过MTT比色法测定细胞存活率，确定使用I6h-R24h作为糖氧剥夺/复氧模型。经I6h-R24h损伤后的细胞随机分为空白对照组、溶剂对照组、盐酸双苯氟嗪10μmol/L组、盐酸双苯氟嗪1μmol/L组、盐酸双苯氟嗪0.1μmol/L组和氟桂利嗪（Flu）1μmol/L组。分别测定各组神经元细胞MTT 许多 OD值、LDH漏出、胞内钙离子浓度、NO含量、NOS活性、细胞凋亡率，以评价盐酸双苯氟嗪的保护作用并研究其机制。 结果：（1）经不同浓度盐酸双苯氟嗪干预的细胞，MTT测定的OD值明显增高，显示细胞活性升高，LDH漏出显著降低，表示细胞受损程度减小。（2）糖氧剥夺/复氧可致海马神经元胞浆内钙离子超载，盐酸双苯氟嗪可减轻由糖氧剥夺/复氧所致的海马神经元钙超载，其中高浓度组（238.50±7.73）与溶剂组(319.40±10.79)相比有显著性差异（P＜0.01）。（3）糖氧剥夺/复氧损伤会使细胞NO含量与NOS活性都明显升高，不同浓度的盐酸双苯氟嗪与Flu能够不同程度的改善此种损伤变化。（4）原位凋亡实验结果显示，正常对照组细胞可见有少量凋亡细胞（41.30±1.78），糖氧剥夺/复氧损伤使凋亡细胞数目明显增多（152.20±2.29，P＜0.01），盐酸双苯氟嗪可降低凋亡细胞数目，其中高浓度组（60.70±1.61）和中浓度组（100.10±1.94）与溶剂组相比有显著性差异（P＜0.01）。
Bcl-2 phosphorylation 结论：盐酸双苯氟嗪可能通过阻断糖氧剥夺/复氧所致海马神经元胞浆内游离钙离子浓度， NO含量以及NOS活性的升高，改善糖氧剥夺/复氧引起的海马神经元损伤，发挥抗凋亡的作用。
目的：对融合蛋白d-EGF二级、三级结构进行预测并分析其活性部位的可能影响，进行原核表达，并对表达产物进行分析鉴定。方法：以融合蛋白质基因序列为基础，用DNAStar软件预测其蛋白质的二级结构；用Insight II软件对其三级结构进行建模预测。在对融合蛋白理论预测的基础上，分别构建含β-defensin-3、EGF的重组质粒，应用重组PCR等方法，将EGF的基因序列融合到β-defensin-3DNA序列的3’末端，将融合基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建目的重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法对目的基因是否正确重组进行鉴定；以重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），以IPTG诱导表达目的蛋白质，表达产物经过Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达初产物及纯化产物。最后用Western-blot对其特异性进行鉴定；用MTT法检测其促细胞增殖活性；用纸片扩散法药物敏感试验、微量稀释法检测其抗菌活性。结果：采用DNAStar软件的Gamier Robson方法预测的结果表明，融合蛋白质d-EGF含较多的β折叠结构；Charge Density-Charge法预测蛋白质3-22、31-48区段带丰富的正电荷；Insight II软件分析显示重组蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三级结构中的活性必须的六个链内二硫键在融合蛋白中都能够正确形成，维持β-defensin-3三级结构的3个反向平行的β折叠片结构在融合蛋白中能够形成。融合蛋白的结构含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性结构。成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。转入重组质粒的E.