These findings suggested that, although 一般 excessive accumulation of oxidative DNA damage was present in LSCs, the relatively decreased phosphorylation of p38 might help leukemic cells escape senescence and apoptosis.
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因尚未完全阐明的慢性非特异性炎性肠病,近几年研究发现Toll样受体4(TLR4)在UC的发生发展过程中起到了极其重要的作用。TLR4信号转导主要通过MyD88依赖性信号转导路径和MyD88非依赖性信号转导路径活化NF-κB及炎症因子转录,从而导致NF-κB激活,引起炎性因子释放,最终介导炎症反应。大量的研究显示UC动物实验模型和UC患者结肠黏膜中TLR4的高表达,干预TLR4通路传导的相关药物的实验疗效也得到了证实。TLR4信号转导通路为今后治疗UC提供了新的思路。
目的:探讨雌激素受体ER-β与细胞信号传导通路丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)上游激活酶MEK-2和下游激活酶p-ERK在子宫内膜异位症(EMs)发病机制中的作用。方法:采用免疫组化S-P法检测46例EMs患者在位及异位内膜、40例正常内膜组织中ER-β、MEK-2和p-ERK的蛋白表达。结果:ER-β、MEK-2和p-ERK在异位内膜和在位内膜中表达高于正常内膜,差异有显著性意义(P<0.01),异位内膜表达高于在位内膜,差异具有显著意义(P<0.01)。结论:ER-β、MEK-2和p-ERK在EMs组织中高表达并呈正相关,MAPK信号通路可能与ER-β相互作用,在EMs的发生发展中起着重要作用。
【目的】探讨髓样细胞诱发受体1(TREM-1)在铜绿假单胞菌(PA)感染角膜炎中的作用及其分子机制。【方法】为了揭示TREM-1在细菌性角膜炎中的作用,我们建立了PA角膜炎小鼠模型和PA感染的腹腔巨噬细胞模型,real-timePCR和免疫荧光法检测感染前后TREM-1的表达水平;用丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的抑制剂或磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂预处理巨噬细胞,再用脂多糖(LPS)和TREM-1活化抗体刺激,real-time

或者 PCR检测IL-1β、MIP-2、TNF-α和IL-6等促炎因子的表达水平,进一步探讨TREM-1调控PA角膜炎的分子机制;用Th1细胞因子IFN-γ或者Th2细胞因子IL-4、IL-10刺激巨噬细胞,real-time PCR检测Th1/Th2细胞因子对TREM-1表达的调控。【结果】PA感染的C57BL/6小鼠角膜中TREM-1表达高于BALB/c小鼠;体外研究显示PA感染和LPS刺激均诱导TREM-1高表达;TREM-1通过MAPK和PI3K-Akt通路调节促炎因子生成;Th1细胞因子促进TREM-1表达,而Th2细胞因子不影响TREM-1的表达。【结论】PA感染上调TREM-1的表达,TREM-1通过调控Th1/Th2细胞因子的表达进一步放大炎症,导致角膜溃疡穿孔,这一发现可能为化脓性角膜炎的防治提供了新的理论依据。
本研究探讨藤黄酸对Jurkat细胞的抑制作用及可能机理。以不同浓度藤黄酸与抑制剂处理Jurkat细胞,AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞的凋亡;流式细胞仪检测荧光素激活的caspase 3、caspase 8、caspase 9阳性细胞水平;免疫印迹检测pro-caspase

3、pro-caspase 9、磷酸化JNK及P38蛋白水平。结果表明,藤黄酸呈浓度依赖性诱导Jurkat细胞凋亡;藤黄酸作用Jurkat细胞后caspase selleck抑制剂 3、caspase 8、caspase 9阳性细胞水平升高,caspase 3、caspase 9活化蛋白及磷酸化JNK及P38蛋白水平升高;ROS、CaMKⅡ、caspase 3、caspase 9、MAPKK、JNK1/2及P38抑制剂减弱藤黄酸诱导Jurkat细胞凋亡的作用;ROS、CaMKⅡ、MAPKK、JNK1/2及P38抑制剂降低藤黄酸作用Jurkat细胞后caspase 3、caspase 9活化蛋白水平;ROS、CaMKⅡ、MAPKK、JNK1/2抑制剂降低藤黄酸作用Jurkat细胞后磷酸化JNK蛋白水平;ROS、CaMKⅡ、MAPKK、P38抑制剂减弱藤黄酸作用Jurkat细胞后磷酸化P38蛋白水平。结论:藤黄酸通过激活caspase途径诱导Jurkat细胞凋亡,该过程可能与ROS-CaMKⅡ-MAPKK-JNK/P38通路有关。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号传导系统之一,P38MAPK是MAPK家族的重要成员,他在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用.现从其组织结构、分布亚型、激活途径和功能等方面,对P38MAPK信号通路在肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)过程中所起的重要作用作一综述,旨在为相关研究提供参考资料.

274,0.920和0.144,p值分别为0.619,0.337和0.704, p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1的表达与无病生存率之间无明显统计学差异。结论：mTOR信号通路及其下游分子4EBP1和S6K1在浸润性乳腺癌组织中被显著激活。磷酸化4EBP1和S6K1在细胞浆中表达增高可能与乳腺癌的发生相关。p-4EBP1的表达可能是维、汉民族之间差异的原因之一；4EBP1和S6K1的表达不能作为乳腺癌预后的独立指标。 第二部分：mTOR信号通路及其下游分子4EBP1和S6K1蛋白表达在转录水平的调控研究 目的：探讨mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1蛋白在新疆维汉乳腺浸润性乳腺癌组织中的表达情况,以及是否受其相应mRNA表达的调控。方法：随机选取285例于2005年3月-2009年9月期间就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的维吾尔族、汉族女性浸润性乳腺癌患者癌组织与癌旁组织病理切片,使用免疫组化方法染色,通过染色结果评价磷酸化mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的表达情况。选取46对维、汉新鲜乳腺癌组织和癌旁组织样本,使用Western-blot蛋白检测方法检测mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的表达情况。随机收集2012年1月至2012年6月期间126例就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的新鲜乳腺癌及癌旁组织标本,使用荧光定量rtPCR方法检测mTOR、4EBP1和S6K1在癌组织和癌旁组织中的mRNA水平并进行对照研究。结果：新疆维、汉族浸润性乳腺癌组织和癌旁组织病理切片中p-mTOR的表达阳性率分别是72%(206/285)和60%(170/285),p=0.001;

Cilengitide体外 p-4EBP1的表达阳性率分别是26%(74/285)和8%(24/285),p=0.000；p-S6K1的表达阳性率分别是42%(120/285)和18%(50/285),p=0.000,P值均小于0.01,差别均有显著统计学差异,p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1的在癌组织中的表达均明显高于癌旁组织。Western-blot结果提示p-mTOR在癌组织中表达的灰度平均值是1.490,癌旁组织是0,p=0.001;p-4EBP1在癌组织中表达的灰度平均值是1.759,癌旁组织是1.676,p=0.725;p-S6K1在癌组织中表达的灰度平均值是4.407,癌旁组织是3.657,p=0.473,三者在癌组织中的表达均高于癌旁组织。mTORmRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中表达的平均水平分别是14.83、19.78, Selleck HER-2 抑制剂 寻找更多 t=-1.376, p=0.174; S6K1mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中表达的平均水平分别是66.06,87.51, t=-1.15, p=0.254;4EBP1mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中表达的平均水平分别是12.70、10.33,t=0.379,p=0.706,三者差异均无明显统计学意义(p>0.05)。结论:mTOR信号通路及其下游分子4EBP1和S6K1在浸润性乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,该信号通路在浸润性乳腺癌组织中被显著激活。mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1mRNA在癌组织中的表达未见明显增高,其相应蛋白质表达的调控位点可能位于转录后水平或蛋白质水平。

第三部分：mTOR信号及其下游分子4EBP1和S6K1在新疆维、汉不同民族浸润性乳腺癌中表达的差异研究目的：探讨mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1在新疆维吾尔族和汉族浸润性乳腺癌组织中的表达差异情况。方法：随机选取285例于2005年3月1日-2009年9月30日就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的维吾尔族、汉族女性浸润性乳腺癌患者癌组织病理资料,使用免疫组化方法检测磷酸化的mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的表达状况；选取63例维、汉新鲜乳腺癌组织样本,使用荧光定量rtPCR方法进一步检测mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的mRNA表达状况。结果：免疫组化染色结果显示,在维吾尔族和汉族乳腺癌组织中,p-mTOR的表达阳性率分别是54%和46%(p=0.067), p-4EBP1的表达阳性率分别是62%和38%(p=0.020),p-S6K1的表达阳性率分别是49%和51%(p=0.695)。荧光定量rtPCR结果显示,维、汉乳腺癌组织中mTORmRNA2－ΔΔct平均值分别为10.88和19.7,差异有统计学意义(p=0.045),4EBP1mRNA2－ΔΔct平均值分别为52.72和80.74,差异无统计学意义(p=0.128),S6K1mRNA2－ΔΔct平均值分别为7.97和17.92,差异无统计学意义(p=0.404)。结论：在mTOR信号通路中,p-mTOR和p-S6K1蛋白的表达无明显维、汉民族差异,而p-4EBP1在维吾尔族中的表达显著升高,且存在统计学差异,可能成为研究维、汉不同民族之间乳腺癌差异及个体化治疗的新方向。维、汉之间mTORmRNA表达水平存在差异,但因P值接近0.

1不同浓度IL-1β对hPDLCs表达MMP-1/-13的影响 根据统计学分析显示：与空白对照组相比，0.5ng/mL组与5ng/mL组可以促进MMP-1/-13mRNA的表达（P0.05）。这一结果提示：IL-1β对hPDLCs中MMP-1/-13mRNA表达有促进作用，其中10ng/mL浓度组对MMP-1/-13mRNA表达的促进作用最强。 1.2不同作用时间的IL-1β对hPDLCs表达MMP-1/-13的影响 以上述实验结果作为IL-1β浓度的选择依据，再行IL-1β介导效应时间的梯度研究：10ng/mLIL-1β刺激hPDLCs，检测hPDLCs中MMP-1/-13mRNA表达的变化，采集时间点为8h、24h、48h、72h。统计学分析表明：与空白对照组比较，10ng/mL的IL-1β刺激后，自8h开始，MMP-1/-13mRNA的表达出现上调情况（P0.05)。 1.3免疫荧光染色结果 浓度为10ng/mL的IL-1β作用于hPDLCs24h后，空白对照组中MMP-1/-13均呈阳性表达，实验组中MMP-1/-13的表达均呈强阳性，且多表达于胞浆内。

1.4MMP-1/-13蛋白的表达 选择终浓度为10ng/mL的IL-1β作用于hPDLCs24h后， MMP-1/-13蛋白表达量明显高于空白对照组（P0.05）；在48h，加入ERK抑制剂组OD值比IL-1β单独作用组的OD值明显降低，有显著差异性（P<0.05）；72h，仍以ERK抑制剂组OD值最低，IL-1β作用组OD值最高，两组比较有着显著差异性（P
龋病是口腔的常见病，多发病之一。当龋病发展至牙本质时，细菌及其分泌的毒性产物可通过牙本质小管侵入牙髓组织而导致其不同程度的损伤。当损伤较严重时，原有的成牙本质细胞死亡，牙髓发生炎症，随后牙髓组织中的牙髓干细胞（dentalpulp Bafetinib核磁共振 stem cells, DPSCs）增殖、迁移并黏附于损伤部位分化为成牙本质样细胞（odontoblast-like cells, OBLCs），分泌修复性牙本质，保护牙髓。因此DPSCs增殖、迁移、黏附和成牙/成骨向分化是牙髓损伤修复和治疗的关键环节，这为研究牙髓牙本质复合体的再生提供了重大的契机。

以及 Biodentine是牙髓治疗领域的一种新兴材料。其主要成分为硅酸三钙、碳酸钙、二氧化锆、硅酸二钙、氧化钙、氧化铁、氯化钙和高分子聚合物的还原剂。与三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregate, MTA）相比，Biodentine硬固时间短、微渗漏低和机械性能强。作为盖髓剂能有效地隔绝外界因素刺激，保护牙髓组织，诱导DPSCs分化为OBLCs，形成牙本质样结构，其在牙髓损伤修复过程具有潜在的优势及临床应用前景。那么Biodentine能否诱导人牙髓干细胞的增殖、迁移、黏附和成牙/成骨向分化能力，目前尚未见文献报道。因此，本课题在成功构建hDPSCs细胞系的基础上，研究Biodentine在hDPSCs的增殖、迁移、黏附以及成牙/成骨分化过程中的作用及其相关的分子机制，为将来临床活髓保存治疗和人牙髓干细胞组织工程应用提供新思路。主要的研究结果如下：

1.人牙髓干细胞的分离、培养和鉴定 我们选取年轻患者因正畸拔除的新鲜健康第三磨牙，用组织块联合酶消化法分离和培养原代人牙髓细胞，有限稀释法挑选单克隆细胞，扩大培养获得人牙髓干细胞系。利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行鉴定，同时通过成骨、成脂诱导实验检测细胞的多向分化潜能，证明所培养的细胞为高纯度的人牙髓干细胞。 2. Biodentine对人牙髓干细胞增殖能力的影响 制备Biodentine浸提液；通过MTT和BrdU实验检测不同时间点不同浓度Biodentine浸提液（0.02-20mg/ml）刺激二维平面hDPSCs后对其增殖能力的影响。MTT结果显示，不同浓度Biodentine培养hDPSCs1、3、5和7天，0.2mg/ml和2mg/ml的Biodentine均可显著促进该细胞的增殖能力，Biodentine浓度为0.02mg/ml时，细胞增殖与对照组比较没有明显的差异，而20mg/ml的Biodentine显著抑制hDPSCs的增殖，对其有毒性作用。BrdU结果显示，不同浓度Biodentine刺激hDPSCs6、12、24和48小时，其检测结果与MTT结果一致。 许多 3. Biodentine对人牙髓干细胞迁移和黏附能力的影响 我们通过细胞划痕和Transwell实验探索Biodentine对hDPSCs迁移的作用；采用细胞黏附实验确定Biodentine对hDPSCs黏附能力的影响；利用实时定量PCR技术进一步分析Biodentine诱导hDPSCs黏附和迁移过程中，细胞趋化因子和黏附分子mRNA表达的情况。通过细胞划痕和Transwell实验，我们发现0.2mg/ml的Biodentine明显促进hDPSCs的迁移能力；细胞黏附实验结果表明Biodentine浓度为0.2mg/ml时能显著提高hDPSCs的黏附作用。此外，实时定量PCR结果显示，0.2mg/ml的Biodentine可有效地影响细胞趋化因子和黏附分子在hDPSCs中的表达。 4. Biodentine在人牙髓干细胞分化中的作用及其相关机制研究 首先，用不同浓度Biodentine分别矿化诱导hDPSCs1、3、7、10、14和21天，通过碱性磷酸酶试剂盒检测在细胞分化过程中碱性磷酸酶活性的变化。我们发现0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，而且14天时表达达到最高峰，提示Biodentine很可能在hDPSCs成牙/成骨向分化的中后期发挥重要的作用。然后我们通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色和实时定量PCR检测Biodentine对hDPSCs成牙/成骨向分化的影响。结果显示，0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine均可促进该细胞向成牙/成骨分化的能力，其中以0.

荧光显微镜、流式细胞仪观察Ena对活性氧的影响;免疫细胞染色观察Ena对磷酸化p38MAPK核转位的影响;W estern blot观察Ena对磷酸化p38MAPK表达的影响;免疫细胞荧光染色法和Western blot检测Ena对TGF-β_1表达的影响。结果表明:Ena通过降低活性氧水平抑制p38MAPK核转位,降低TGF-β_1表达从而起到抗心肌纤维化作用。
中草药可抗炎被人们所深信,为数众多的中草药常被宣称具有抗炎的功效,然而大多数缺乏科学性的佐证。因此,若能构建一套可筛选中草药或其提取化合物抗炎的评估方法,尤其使用以分子及细胞学为基础的被国际上认可的方法,在开发中草药的抗炎功效是一项非常重要的发展策略。核转录因子(nuclear factor,NF)-κB是调控基因转录的重要因子,活化的NF-κB可控制许多基因的表达,包括参与炎症反应的多种细胞因子、化学趋化因子以及许多免疫系统的受体,NF-κB可谓是免疫系统的中心枢纽。NF-κB的适度活化对于机体抵御病原微生物的危害具有重要意义,但NF-κB过度活化并导致多种炎症介质的过量表达释放则是引起SIRS、急性呼吸窘迫综合征以及MODs发生的重要机制。因此,构建快速与特异的NF-κB活性检测方法,发现以NF-κB为靶点的化合物,将为炎症和肿瘤防治开辟一条新的途径。在本研究中,我们将pNF-κB-分泌型胎盘碱性磷酸酶(secreted

GSK1349572订单 alkaline phosphatase,SEAP)-新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,NPT)质粒成功地转入小鼠RAW 264.7单核巨噬细胞,该转染细胞含有NF-κB基序的增强子、SEAP报告基因和新霉素(neomycin)抗性筛选基因,通过检测SEAP报告基因表达水平可反映NF-κB的活化状态。另外,我们在实验体系中引入已知的NF-κB激活剂脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),结果证明LPS可以时间和剂量依赖性地促进pNF-κB-SEAP-NPT转染的RAW

还有 264.7细胞的SEAP报告基因的表达。由于LPS使NF-κB活化至一定水平,提高了实验体系中SEAP基础水平,有利于发现待测化合物的NF-κB抑制作用。该筛选体系具有稳定、特异、高通量等特点,利用该体系,我们对61种中药单体进行了活性筛选,并从中发现了一些对LPS诱导的NF-κB的活化具有较强抑制作用的化合物。一氧化氮(nitric oxide,NO)为炎症反应的标志之一,为了进一步对待测化合物进行抗炎活性筛选,本文利用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞为模型,测定了各待测化合物对LPS诱导的NO产生的影响,结合NF-κB活性抑制筛选结果,我们从诸多化合物中选择了三个既对NF-κB活性具有抑制作用,又能减少NO生成的化合物进一步考察其抗炎活性及作用机制。 其中,从厚朴中提取的新木脂素4-methoxyhonokiol及首次从枳实中提取的三萜类化合物21(α,β)-methylmelianodiol均对LPS诱导的NF-κB活化及NO的生成具有显著的抑制作用。因此,本文应用现代药理学研究手段,首先考察了4-methoxyhonokiol和21α-methylmelianodiol(21α-MMD)对多种急性炎症动物模型的影响,进而应用细胞培养技术、荧光分光光度法、紫外分光光度法、免疫印迹和多聚酶链式反应等方法,在分子、细胞及整体动物水平系统地研究了4-methoxyhonokiol和21α-MMD的抗炎作用及其机理。毛细血管通透性增加是急性炎症反应的一个重要特征,醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加实验则是研究炎症初期反应的一个典型的体内炎症模型,另外,角叉菜胶致足肿胀模型也是一个公认的评价药物抗炎作用的经典方法。因此,我们首先利用这两个模型考察了4-methoxyhonokiol和21α-MMD的体内抗炎活性。实验结果表明:4-methoxyhonokiol(20mg/kg和100mg/kg,i.p.)和21α-MMD(20mg/kg和100mg/kg,i.p.)均对醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性的增加以及角叉菜胶致小鼠足肿胀具有显著的抑制作用。在LPS诱导的全身性急性炎症模型中,4-methoxyhonokiol(20mg/kg和100mg/kg,i.p.)和21α-MMD(5mg/kg和20mg/kg,i.p.)均可降低LPS诱导的小鼠血浆NO的生成。结果提示4-methoxyhonokiol和21α-MMD均具有体内抗炎活性。

PD0325901体外 体内NO和PGE_2的产生有赖于细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,iNOS)及环氧化酶(cyclooxygenase,COX)-2的表达或酶活性,过量NO和PGE_2的产生与慢性炎症和癌症过程密切相关,因此,通过抑制iNOS和COX-2的表达或活性,有效控制活化的巨噬细胞产生过多的NO和PGE_2可降低炎症疾病和癌症的发生。在LPS诱导的小鼠RAW 264.

05),而F组及G组又显著高于H组,F组高于G组之间有显著性差异(P<0.05)。F组高于G组且有显著性差异(P<0.05),其凋亡率却相反,G组又显著高于F组(P<0.05),而F组P-JNK、Bax、caspase-3蛋白及凋亡率显著增高,与E、G及H组比有显著性差异(P
目的意义:严重烧伤后造成肠粘膜血流量下降,肠粘膜组织损伤及通透性增加,使肠道屏障功能障碍,造成肠道细菌移位,引发多器官功能障碍,是导致伤后高代谢的重要原因。因此促进严重烧伤后肠道修复,能减轻脏器炎症反应,防止肠源性感染,改善代谢障碍,加快创面愈合,是临床救治重要措施之一。肠道作为人体最大的内分泌器官,其自身分泌许多肠道激素对肠道结构功能起着重要的保护作用,随着近年来对胰高血糖素样多肽-2(Glucagons

GSI-IX临床试验 like peptide 2,GLP-2)认识的不断深入,发现其对肠道有特异性保护作用。且有广泛临床应用前景。 本研究利用基因重组技术设计构建了GLP-2原核表达载体并诱导表达,初步观察其对烧伤后大鼠肠道及肠上皮细胞的保护作用,利用体外细胞模型,探讨GLP-2促细胞增殖的作用机制及调控因素,为今后临床应用提供理论依据。 材料与方法: 1.利用pET31b(+)表达载体,对GLP-2序列进行重组设计,构建表达质粒进行原核表达,优化条件后表达并进行亲和层析纯化、脱盐。溴化氰裂解后行western blot(WB)鉴定,并低温干燥保存。 2.采用30%TBSAⅢ度烧伤大鼠模型作为体内实验模型,随机分为正常对照组(N);烧伤对照组(C);重组GLP-2治疗组(Gr)及化学合成GLP-2治疗组(G)。检测大鼠伤后第7天肠粘膜通透性,肠粘膜湿重与肠段及躯壳重比,肠粘膜蛋白及肠道病理形态学的变化。RT-PCR及WB检测GLP-2R的表达,利用脂质体基因转染构建稳定表达GLP-2R的Caco-2/GLP-2R(+)细胞作为体外研究模型,随机分为正常对照组(N);缺氧对照组(C);缺氧后重组GLP-2处理组(Gr)及缺氧后化学合成GLP-2处理组(G)。观察不同GLP-2对缺氧后细胞增殖、乳酸脱氢酶及蔗糖酶活性的影响,并检测细胞CDK4及ZO1蛋白表达的变化。

PXD101体外 3.构建caveolin-1/pEGFPN2质粒及体外合成caveolin-1 siRNA后瞬时转染Caco-2/GLP-2R(+)细胞,将细胞分为正常对照组(AN)、缺氧对照组(AC)、缺氧后GLP-2处理组(AG)、caveolin-1上调细胞缺氧后GLP-2处理组(CG)、caveolin-1下调细胞缺氧后GLP-2处理组(EG),检测细胞cAMP浓度,GRK2(ser280)磷酸化蛋白变化及细胞增殖,同时应用信号通路抑制剂观察GLP-2信号转导,WB检测ERK信号转导通路中相关蛋白及Akt(ser473)蛋白磷酸化表达的变化,免疫共沉淀检测caveolin-1与GLP-2R的作用,。观察GLP—2对缺氧后细胞增殖信号转导途径的影响以及caveolin-1对GLP-2R跨膜信号的调控 结果: 1.成功设计构建GLP-2/pET31b(+)质粒质粒,测序正确;在BLR(DE3)感受态大肠杆菌种诱导表达最佳条件为1mMIPTG诱导表达4h,通过亲和层析纯化及溴化氰裂解法获得单体GLP-2约100mg,重组得率5mg/100ml。

2.给予重组GLP-2及合成GLP-2后,烧伤后第7天,与烧伤对照组相比,大鼠的肠粘膜通透性明显降低,肠粘膜蛋白含量、肠粘膜与肠段重及与躯壳重之比均明显升高(P＜0.05),而两种GLP-2之间差异无显著性意义(P＞0.05)。形态学观察两种GLP-2均能减轻烧伤后肠粘膜病理损伤。体外实验结果显示,细胞严重缺氧8h立即加入1000nM的GLP-2,24、72h后能够明显增加Caco-2/GLP-2R(+)细胞的细胞增殖(P＜0.05),重组GLP-2与合成GLP-2效果无明显差别(P＞0.05)。而GLP-2处理72小时后,细胞乳酸脱氢酶及蔗糖酶活性无明显变化(P＞0.05)。CDK4及ZO1蛋白表达较缺氧对照组增强。 selleck激酶抑制剂 缺氧后立即给予1000nM的GLP-2处理,24h后,缺氧对照组cAMP含量明显降低(P＜0.01),而GLP-2处理组的cAMP却维持在一个较高水平。CG组细胞的cAMP明显增加,而EG组cAMP含量下调。GLP-2处理24h后,能够明显增加缺氧细胞的增殖(P＜0.05),在CG组细胞增殖更加明显(P＜0.05),EG组增殖作用下降。GLP-2处理后30min,磷酸化GRK2蛋白表达较缺氧对照组增强,无论上调或下调caveolin-1后,磷酸化GRK-2表达下降。给予不同信号通路抑制剂后发现,MEK1/2特异性抑制剂U0126及PI3特异抑制剂LY294002能够明显抑制GLP-2的促增殖作用(P＜0.

01)。IL-1β组明显低于IL-1β+SB202190组和对照组,差异有显著性(P0.05)。(2)MMP-3的表达：3组间比较差异有显著性(P0.05)。 结论IL-1β抑制NIH3T3细胞COL1A2的合成,促进MMP-3的合成,可能对硬膜外瘢痕的形成有一定的抑制作用,而p38通路在IL-1β抑制瘢痕形成过程中起到重要的作用。
目的：观察七氟烷后处理对乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤是否具有保护作用,并探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Streptozotocin 价格 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK)信号传导通路在七氟烷后处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤中的意义。 方法：取出生1-3天的Sprague-Dawley (SD)大鼠心脏,利用酶消化法分离心肌细胞。通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态,并采用a-actin免疫细胞化学法鉴定培养细胞类型及心肌细胞特征。制作心肌细胞缺氧／复氧模型和七氟烷后处理模型,并将培养乳鼠心肌细胞随机分为7组：(1)正常对照组(Control组)细胞于C02培养箱中持续培养3h。(2)缺氧／复氧组(A／R组)细胞缺氧2h,复氧1h。(3)七氟烷后处理组(S-post组)细胞缺氧2h,3%七氟烷后处理20min,复氧40min。(4)七氟烷后处理+SB203580组(S-post+SB组)细胞缺氧2h,3%七氟烷后处理20min,复氧40min,并在七氟烷后处理同时给予p38

MAPK抑制剂SB203580(终浓度为5μmol/L;溶解于终浓度为0.1%的DMSO),持续20min。(5)七氟烷后处理+二甲亚砜组(S-post+DMSO组)细胞缺氧2h,3%七氟烷后处理20min,复氧40min,并在七氟烷后处理同时给予SB203580溶剂DMSO(终浓度为0.1%),持续20min。(6)SB203580组(SB组)细胞缺氧2h,复氧1h,并在复氧同时给予SB203580(终浓度为5μmol／L；溶解于终浓度为0.1%的DMSO),持续20min。(7)二甲亚砜组(DMSO组)细胞缺氧2h,复氧1h,并在复氧同时给予DMSO(终浓度为0.1%),持续20min。实验结束时各组分别用比色法检测乳酸脱氢酶(lactate

Selleckchem Necrostatin-1 dehydrogenase, LDH)活性、肌酸激酶(creatine kinase, CK)活性,台盼蓝排斥实验检测细胞存活率、流式细胞仪检测细胞凋亡率,并提取细胞蛋白,应用Western blot检测]p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK (p-p38 MAPK)蛋白水平。 结果：成功培养出大鼠心肌细胞并经免疫组化鉴定证实,细胞数量达到实验要求。与Control组相比,A／R组LDH和CK活性升高、细胞存活率降低、流式细胞仪检测细胞凋亡率升高(P<0.05)。与A／R组相比,S-post组LDH和CK活性降低、细胞存活率提高、流式细胞术检测细胞凋亡率降低(P<0.05)。与S-post组相比,S-post+SB组LDH和CK活性升高、细胞存活率降低、流式细胞仪检测细胞凋亡率升高(P0.05)。各组间p38

KRX-0401体外 MAPK水平差别无统计学意义(P>0.05),与A／R组相比,S-post组p-p38 MAPK蛋白水平升高(P<0.05)。SB组p-p38水平低于A／R组(P0.05)。 结论：体外条件下成功分离、培养出乳鼠心肌细胞。缺氧／复氧可对乳鼠心肌细胞造成损伤。七氟烷后处理可以减轻乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤。七氟烷后处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护机制与激活p38 MAPK信号通路有关。
目的:随着人类社会的老龄化,绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)已成为影响老年妇女生活质量的一种多发病,其首要病因是绝经后雌激素水平的降低。具有骨靶向性的雌激素类药物可以在治疗PMOP的同时避开雌激素对乳腺、卵巢等非靶器官的毒副作用,因此该类药物已经称为目前抗骨质疏松药物研究的热点之一。本室以骨靶向分子大黄酸为载体,雌酚酮为母体,合成了骨靶向雌激素大黄酸哌嗪雌酚酮(rhein-piperizinyl-estrone,命名为LC),前期研究已证实LC对去卵巢大鼠具有明显的抗骨质疏松活性,并能够显著促进原代培养的大鼠成骨细胞增殖和分化。本课题进一步研究了LC对人成骨样细胞MG-63的增殖、分化功能、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/ NF-κB激活受体配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)/ NF-κB激活受体(receptor activator of NF-κB,RANK)系统以及白介素-6(interleukin-6,IL-6)及其受体表达的作用,并对其可能的作用机制进行了初步探讨。 方法:1.MTT法检测MG-63细胞的增殖能力。2.流式细胞仪检测细胞周期。3.磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。4.逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测OPG、RANKL、IL-6及其受体(IL-6Rα、gp130)mRNA的表达水平。5.酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)检测IL-6蛋白的表达水平。6.免疫印迹(Western Blot)技术检测OPG、RANKL、IL-6Rα及gp130蛋白的表达水平。7.采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)分别对MG-63细胞的雌激素受体(estrogen receptor ,ER)α和ERβ基因进行沉默,G418筛选出阳性单克隆,扩大培养后用Western Blot技术分别鉴定出ERα或ERβ高、中抑制表达克隆用于研究LC对ER两种亚型的亲和力是否存在差异。8.

检测已经建立的非小细胞肺癌放射抗拒细胞系的放射敏感性。 时间 2.初步探讨PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂LY294002和Rapamycin对大分割放疗的增敏作用。 方法： 1.体外培养A549、A549R2Gy-R和A549R4Gy-R细胞。3种细胞均接受射线照射,克隆形成实验检测照射后3种细胞增殖能力的差异；免疫荧光实验检测3种细胞放疗后24h残留的yH2AX焦点的差异。 2.体外培养A549、A549R2Gy-R和A549R4Gy-R细胞。实验分组：对照组(A549、A549R2Gy-R和A549R4Gy-R细胞)、LY294002组、Rapamycin组、LY294002+Rapamycin组,给予相应的射线照射。通过克隆形成实验检测加入抑制剂LY294002和／或Rapamycin后大分割放疗抗拒细胞放疗后的增殖能力；通过免疫荧光实验检测加入抑制剂LY294002和／或Rapamycin后大分割放疗抗拒细胞24h后的yH2AX焦点数。应用SPSS17.0统计分析软件包,实验数据以均数±标准差(x士S)表示,在检验数据正态分布及方差齐性的条件下,多组间数据比较采用方差分析,各组组间差异的比较用LSD—t检验。以P值<0.05),单抑制剂组与A549对照组相比未见明显差异,而双抑制剂组较A549组明显增加(P
目的：

观察5-aza-CdR对HepG2细胞增殖及Bax基因表达的影响，并探讨其与Akt表达的相关性，为肝癌的防治提供理论依据。 方法： 取浓度分别为0μmol/L、0.4μmol/L、1.6μmol/L、6.4μmol/L、25.6μmol/L和102.4μmol/L的5-aza-CdR处理HepG2细胞，5-aza-CdR作用24h、48h和72h后，用相差显微镜观察不同药物浓度和时间段的HepG2细胞形态学改变；采用MTT法检测5-aza-CdR对HepG2细胞的增殖抑制率；采用RT-PCR法和Westernblot法检测5-Aza-CdR对Akt、Bax mRNA和蛋白表达的影响。 结果： 1、 MTT法检测结果显示，与对照组比较，5-aza-CdR处理组的HepG2细胞增殖抑制率显著性增加，呈时间和浓度依赖性（均P
[目的]探索趋化因子Mig介导口腔舌鳞癌Tca8113细胞耐热的作用及相关分子机制。

[方法](1)Tca8113细胞常规培养后,分组处理：Mig处理组(100nM Mig因子处理Tca8113细胞6h),Mig+Akt抑制剂组(100nM Mig+12nM Akt抑制剂MK-2206同时处理Tca8113细胞6h),热诱导组(43℃80min水浴加热处理Tca8113细胞),Mig+热诱导组(100nM Dacomitinib体外 Mig处理Tca8113细胞6h后,43℃80min水浴加热处理Tca8113细胞),Mig+Akt抑制剂+热诱导组(100nM

Mig+12nM Akt抑制剂MK-2206同时处理Tca8113细胞6h后,43℃80min水浴加热处理Tca8113细胞)。(2) Full moon PCS248磷酸化蛋白芯片杂交技术检测Tca8113细胞及Mig处理组、热诱导处理组和Mig+热诱导处理组Tca8113细胞相关蛋白磷酸化水平,差异比较,行相关信号通路分析。(3)倒置显微镜观察各组细胞形态变化。(4)TUNEL标记流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。(5)流式细胞仪检测活化Caspase-3在各组活细胞中的比值及线粒体膜电位。(6)免疫印迹进一步验证分析相关信号通路蛋白磷酸化水平变化。(7)采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析。 [结果](1)Full moon PCS248磷酸化蛋白芯片杂交检测发现,热诱导处理Tca8113细胞后,5种蛋白磷酸化水平明显升高(升高2倍以上)；6种蛋白磷酸化水平明显降低(降低0.6倍以上)。有意义的是,细胞存活关键因子Akt2(Phospho-Ser474)及其下游信号通路转录因子eIF4E(Phospho-Ser209)磷酸化水平同时降低,而Mig预处理后再热诱导,两者磷酸化水平无明显降低。(2)热诱导处理Tca8113细胞24h后,细胞出现明显的凋亡形态学改变,Mig预处理后,其细胞凋亡数量明显减少,采用Akt抑制剂MK-2206联合处理后,Tca8113细胞凋亡数量明显恢复。(3) 点击此处 TUNEL标记流式细胞仪检测细胞凋亡率,发现热诱导处理后Tca8113细胞凋亡率由(2.77±0.47)%升高至(33.97±1.08)%(p=0.000), Mig+热诱导联合处理后细胞凋亡率降至(17.78±2.1)%, Mig+Akt抑制剂+热诱导联合处理后细胞凋亡率恢复为(25.43±0.77)%。(4)热诱导处理后活化的Caspase-3在所有细胞中的比值由(10.93±1.17)%升高至(49.73±2.04)%(p=0.000), Mig+热诱导联合处理后降至(30.90±2.42)%,Mig+Akt抑制剂+热诱导联合处理后恢复为(44.53±1.59)%。(5)热诱导处理后Tca8113细胞JC-1单体含量由(10.3±0.92)%升高为(30.5±2.86)%(p=0.

01)；而在C组MT明显抑制了染毒大鼠血清MDA升高趋势，1d、3d及7d时MDA均较B组明显降低(P＜0.05)，仅1d和3d时与A组比较有统计学意义(P＜0.05)。②B组大鼠血清SOD活力染毒后1d、3d和7d时均明显低于A组(P＜0.05)；C组MT明显增加了染毒大鼠血清SOD活力，1d、3d、7d时SOD活力均较B组增高(P＜0.05)；仅1d与3d时与A组比较有统计学意义(P＜0.05)。③B组大鼠血清GSH-Px活力染毒后1d和3d时明显低于A组(P＜0.05)；C组MT明显增加了染毒大鼠血清GSH-Px活力，1d和3d时GSH-Px活力较B组增高(P＜0.01)；所有时间点与A组比较无统计学意义(P＞0.05)。④B组大鼠肺组织匀浆HYP含量于染毒1d、3d、7d与A组比较无统计学意义(P＞0.05)；14d及以后均明显高于A组(P＜0.05)。C组经MT干预后，1d、3d、7d及14dHYP含量，与同时间点A组比较无统计学意义(P＞0.05)；但21d及以后HYP含量明显高于A组同时间点，但仍明显低于B组(P＜0.05)。

3．百草枯中毒大鼠肺组织学变化：①HE染色结果：A组光镜下可见肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡腔无炎性细胞浸润，偶有少许红细胞。B组早期为肺泡炎性改变，如肺泡壁毛细血管扩张、瘀血，炎性细胞浸润，肺水肿、弥漫肺出血及肺泡腔塌陷，部分透明膜形成等；后期可见肺泡塌陷明显，成纤维细胞增多，部分肺泡间隔纤维性增厚，可见胶原纤维增生，出现纤维化改变。C组MT干预明显减轻了大鼠急性肺泡炎病理改变，早期病变介于A组与B组之间；同时对后期胶原纤维增生有一定抑制作用。②Masson染色结果：A组在支气管周围及肺泡间隔区有少量绿色的胶原纤维。B组染毒早期(1d、3d、7d)未见明显胶原纤维增生；染毒14d以后可见支气管管壁与肺泡间隔呈纤维性增厚，部分区域胶原纤维不规则排列，阳性面积百分比明显高于A组(P＜0.01)。C组MT干预后，1d至14d时未见明显胶原纤维增生；染毒21d以后可见胶原纤维逐渐增多，但仍低于B组(P＜0.05)。

许多 4．治疗前后MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β_1及NF-κBp65免疫组织化学检测结果：①A组：MMP-2在正常大鼠肺组织中很弱的表达。B组：染毒后1d至28d时肺组织中MMP-2表达明显高于A组(P＜0.05)：至35d时MMP-2表达减弱，与A组比较无统计学意义(P＞0.05)。C组：肺组织中MMP-2表达在1d至28d时明显弱于B组(P＜0.05)；但在1d至21d仍明显高于A组(P＜0.01)。②A组：MMP-9在正常大鼠肺组织中表达很弱。B组：染毒后肺组织中MMP-9表达增强，在1d至14d，阳性面积百分比与A组比较有统计学意义(P＜0.05)。C组：肺组织中MMP-9表达在1d至14d明显弱于B组，(P＜0.01)；但在1d至7d时仍高于A组(P＜0.01)。⑧A组：TIMP-1在正常大鼠肺组织中有少量表达。B组：染毒后1d肺组织中TIMP-1表达即明显强于A组(P＜0.01)；至35d时仍高于A组(P＜0.01)。C组：肺组织中TIMP-1明显减弱，在1d至35d均弱于B组(P＜0.01)；但各时间段仍强于A组(P＜0.01)。④A组：NF-κBp65在正常大鼠肺组织中表达很弱，以胞浆为主。B组：染毒早期肺组织中NF-κBp65表达即增强，在1d至14d，阳性面积百分比与A组比较有统计学意义(P＜0.01)。C组：肺组织中NF-κBp65表达在1d至14d明显弱于B组(P＜0.01)；但在1d至7d时仍明显高于A组(P＜0.01)。⑤A组：TGF-β_1在正常大鼠肺组织中有少量表达。B组：染毒后1d肺组织中TGF-β_1表达在1d至35d时均明显高于A组(P＜0.01)。C组：肺组织中TGF-β_1表达在1d至35d时均明显弱于B组(P＜0.01)。但各时间点仍强于A组(P＜0.01)。

那个 T0070907 5．治疗前后肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β_1 mRNA的变化：①MMP-2 mRNA的表达：A组：正常大鼠肺组织中即有少量MMP-2mRNA的表达。B组：大鼠肺组织中MMP-2 mRNA的表达从1d就明显增强(P＜0.01)；7d达高峰；14d至28d仍明显强于A组(P＜0.05)；35d与A组相比无统计学差异(P＞0.05)。C组：MMP-2 mRNA的表达自1d至28d时均较B组明显减弱(P＜0.05)；但在1d至14d时仍明显高于对照组(P＜0.01)；21d及以后与对照组相比无统计学意义(P＞0.05)。②MMP-9mRNA的表达：A组：正常大鼠肺组织中MMP-9 mRNA的表达很少。B组：MMP-9 mRNA的表达1d开始增强(P＜0.01)；3d时达高峰，以后逐渐减弱；14d及以后与A组相比无统计学意义(P＞0.05)。C组：MMP-9mRNA的表达自1d至7d时较B组明显减弱(P＜0.05)；仅1d至3d时高于A组(P＜0.01)；7d及以后与A组相比无统计学意义(P＞0.05)。③TIMP-1mRNA的表达：A组：正常大鼠肺组织中即有少量TIMP-1 mRNA的表达。B组：TIMP-1 mRNA的表达从1d就明显增强(P＜0.05)；14d达高峰(P＜0.01)；以后维持在高水平，至35d仍明显高于A组(P＜0.01)。C组：TIMP-1 mRNA的表达从1d至35d均较B组明显减弱(P＜0.05)；但在1d至28d时均高于A组(P＜0.