1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡过程中,caspase-3作为上游因子调控caspase-6的活化。(7)问号钩体诱导J774A.1细胞内JNK和p38MAPK发生磷酸化激活。(8)JNK和p38MAPK抑制剂对问号钩体诱导的J774A.1细胞凋亡、caspase-3、-8的活化及FADD蛋白表达上调均具有抑制作用。 结论:(1)问号钩体对不同类型宿主细胞具有不同的死亡诱导效应,具体表现为问号钩体能够以浓度和时间依赖方式诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)和小鼠原代巨噬细胞发生凋亡;问号钩体对人脐静脉内皮细胞(EVC304和HUV-EC-C)无凋亡或坏死诱导作用;问号钩体诱导人肺泡上皮细胞(A549)发生坏死。(2)问号钩体可通过FADD-caspase-8凋亡传导途径激活下游效应caspase-3、-6,并进而诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)和小鼠原代巨噬细胞凋亡,线粒体细胞色素c-caspase-9途径可能不参与此凋亡诱导过程。(3)问号钩体感染可导致J774A.1细胞内JNK和p38MAPK信号传导系统的激活,JNK和p38MAPK通过调控caspase-3、-8的活化及FADD蛋白的表达上调参与了问号钩体诱导的J774A.1细胞凋亡。这些结果为理解问号钩体诱导凋亡的细胞和分子机制提供了新的思路。
第一部分mTORCl在造血干细胞体外扩增过程中的活化规律

已经 目的：mTORCl掌控了细胞多种生命过程,研究表明过高的mTORCl活性会破坏细胞内坏境平衡。本研究的目的是探讨造血干细胞在体外扩增过程中,胞内的mTORCl活性的变化规律。 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞,应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞,应用Rapamycin作为mTORCl抑制剂,以DMSO作为对照。扩增10天,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集扩增后细胞,流式检测胞内mTORCl底物p70

s6k磷酸化状况。 结果：Lin-Sca-1+细胞在细胞因子的刺激下开始增殖,第6天时细胞扩增了25±4.5倍,到了第10天时,细胞扩增了82±5.2倍。磷酸化p70 s6k的表达与之相应。在未扩增初始的状态下,只有5.82±3.12%的细胞表达磷酸化p70 s6k,扩增了6天以后,22.4±4.67%的细胞表达磷酸化p70 s6k,而扩增了10天以后,73.4±5.23%的细胞表达磷酸化p70 s6k；在第6天的时候加入Rapamycin可以有效的抑制磷酸化p70s6k的表达,但是并没有完全抑制磷酸化p70 s6k的表达。 结论：mTORCl在10天的小鼠造血干细胞体外扩增过程当中,前6天呈现一定水平的激活,在扩增的第7-10天呈现一个剧烈激活的过程,这个过程和总细胞的大量扩增相呼应。 第二部分抑制mTORCl异常活性促进造血干细胞体外扩增以及干性维持 目的：mTORCl过高活性会导致造血干细胞池的耗竭,而Rapamycin为m TORC1有效抑制剂。在上一部分的研究中已经发现mTORCl在扩增7-10天出现剧烈激活过程,本部分研究目的就是利用Rapamycin抑制mTORCl在小鼠造血干细胞扩增第7-10天呈现的剧烈激活,研究其能否进造血干细胞体外扩增以及干性维持。 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞,应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞,应用Rapamycin作为mTORCl抑制剂,以DMSO作为对照。扩增10天,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集扩增后细胞。利用流式检测细胞的表型,利用CAFCs (Cobblestone Area-Forming Cells)法检测体外造血干细胞的功能,利用竞争性移植的办法检测造血干细胞长期造血能力。 有 结果：Rapamycin在第6天加入,在扩增结束以后,会略微的减少有核细胞总的数量,Veh组总的有核细胞数量为2.73±0.33×105,而加Rapamycin组总的有核细胞数量为2.43±0.21×105。但是Rapamycin的加入却增高了LSK+细胞和Lin-Sca-1+细胞在总细胞中的比例,通过计算得出总的LSK+细胞和Lin-Sca-1+细胞的数量,我们发现,Rapamycin相较于Veh可以显著的增加LSK+细胞和Lin-Sca-1+细胞的数量,Veh组分别得到1.27±0.47×104和7.34±3.0×103的Lin-Sca-1+细胞和LSK+细胞,而Rapamycin组则得到1.97±0.56×104和10.64±3.42×103的Lin-Sca-1+细胞和LSK+细胞。当与初始的Lin-Sca-1+细胞比较,计算Lin-Sca-1+细胞扩增的倍数时,Veh组获得了4.2倍的扩增,而Rapamycin获得了6.5倍的扩增。Rapamycin相较于Veh获得了1.5倍的Lin-Sca-1+细胞数量。Rapamycin可以明显的增加day14-CAFCs和day35-CAFCs,可以获得150.67±16.4和9.26±1.45/100,000细胞的dayl4-CAFCs和day35-CAFCs,而Veh则只能获得97.3±7.6和3.53±1.02/100,000细胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs.当计算day35-CAFCs扩增倍数时,即相当于计算体外造血干细胞功能时,Veh获得了0.73±0.08倍的扩增,而Rapamycin获得了1.95±0.25倍的扩增。Rapamycin扩增后的细胞相较于Veh扩增后的细胞在第8周的时候,能更有效的植入照射模型的小鼠体内Rapamycin组CD45.2细胞的植入率为32.23±10.7%,Veh组的植入率为18.16±9.32%；随着时间的延长至32周,Veh组的植入率有所降低,9.93±8.25%,而Rapamycin组的植入率为42.1±11.2%。

http://www.selleck.cn/products/cobimetinib-gdc-0973-rg7420.html 结论：Rapamycin能够促进体外造血干细胞的扩增,并且增强扩增后细胞造血重建的速度和长期造血重建功能,维持其干性。 第三部分抑制mTORCl异常活性促进造血干细胞体外扩增的机制探讨 目的：虽然明确了抑制mTORC1异常活性可以促进造血干细胞体外扩增以及干性维持,但是其机制尚不清楚。在其他细胞环境的研究发现mTORCl活性与干细胞的凋亡,分化,衰老密切相关,本研究的目的是探讨抑制mTORCl活性促进造血干细胞体外扩增及干性维持的机制。 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞,应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞,应用Rapamycin作为mTORCl抑制剂,以DMSO作为对照。扩增10天,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集扩增后细胞。利用流式,免疫荧光,细胞组织化学,聚合酶链式反应检测细胞的周期,衰老等相关分子表达。 结果：通过Annexin-V对凋亡细胞的标记,我们发现Veh组的总细胞Annex in-V表达率为8.93±1.5%,Rapamycin组的总细胞Annexin-V表达率为11.79±3.