5%,猪油10%,蛋黄粉10%,维持料59.5%,蔗糖20%)喂养,高胆固醇+阿伐他汀组在给予小鼠高胆固醇饲料喂养的同时,并用阿伐他汀5
EGFR抑制剂 mg/(kg.d)灌胃,12周后获取血和肝脏。分析血清胆固醇和低密度脂蛋白的变化;肝脏组织切片用于HE染色以观察肝脏组织学病变;应用免疫组化PV法检测肝脏组织中OPN的表达;从冰冻肝脏组织中提取蛋白,用Western blot方法检测OPN变化。我们首先用不同浓度(0、5%、10%)兔高胆固醇血清刺激人肝癌细胞(HepG2)24h,分析OPN表达和ERK、p38磷酸化水平变化情况,再选取明显诱导HepG2细胞OPN表达变化的高胆固醇血清浓度,同时用不同浓度的阿伐他汀刺激HepG2细胞24h,分析OPN表达和ERK、p38磷酸化水平变化。结果:ApoE基因敲除小鼠高胆固醇血症模型复制成功,ApoE基因敲除小鼠在高胆固醇饮食12周后,与正常对照相比血清中胆固醇和低密度脂蛋白含量显著增加(P<0.05,P<0.05);高胆固醇饮食12周加喂阿伐他汀,与高胆固醇饮食组相比血清中胆固醇和低密度脂蛋白含量显著降低(P<0.05,P
【背景】肿瘤的多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是导致化疗失败的主要因素,也是影响患者生存的主要因素。据统计[1、2],有90%以上的肿瘤患者其化疗失败的原因不同程度地与MDR有关。而TGF-beta/Smads信号传导通路在调节肿瘤多药耐药起到非常重要的双向调节作用:肿瘤发生早期,TGF-beta通过其广泛的多细胞抑制达到肿瘤抑制因子的作用;肿瘤形成后期,则促进肿瘤细胞增殖的。 这个 P15,即细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2B,又称Cdkn2b、INK4B,属INK4蛋白家族,又称多肿瘤抑制基因(MTS1)。P15系TGF-beta/smads信号传导系统下游区的十分重要的细胞生长周期的抑制因子,其表达受到TGF
beta的诱导,在TGF beta信号转导通路中主要介导G1期阻滞的作用[3、6]。通过Smad介导的转录和myc所致的生长阻滞的解除,TGF-β可以快速诱导P15在许多不同类型的细胞中的表达[7]。同时TGF-β抑制cdk2激酶活性,提高p15蛋白的表达水平[8]。 所以,本课题拟通过调节HepG2/CDDP耐药细胞株中p15蛋白的表达,进而探讨p15与HepG2/CDDP耐药细胞株多药耐药的相关性及其可能的调控作用机制。 【目的】⑴检测P15在HepG2/CDDP动态的耐药模型中的表达情况。⑵P15对HepG2耐药细胞的表型的作用;⑶探讨p15介导HepG2/CDDP细胞株多药耐药性变化的可能机制。 【方法】⑴采用低浓度逐步递增法,建立HepG2/CDDP动态的耐药模型[9、10、11];⑵将P15编码区片段插入pcDNA3.1以及构建P15正义表达载体,将HepG2耐药细胞分成3组,分别用P15正义表达载体、pcDNA3.1空载体利用脂质体转染到其中2组,另一组为阴性对照组,Western blot验证转染;⑶RT-PCR和Western blot检测P15的表达;⑷流式细胞仪检测HepG2/CDDP耐药细胞株内阿霉素的蓄积和潴留,并以此计算药物的泵出率;⑸流式细胞仪对转染细胞及其对照细胞进行细胞周期分析,并计算细胞的增殖指数(PI);⑹Western
还有 blot检测细胞膜药物转运相关蛋白MRP、P-gp蛋白的表达;⑺Western blot检测及细胞凋亡分子BCL-2、Bax的表达。 【结果】 ⑴成功用顺铂诱导HepG2耐药,并建立HepG2/CDDP耐药模型,耐药指数为6.75μg/ml; ⑵RT-PCR和Western blot检测P15在2.0μg/ml的CDDP诱导培养HepG2/CDDP耐药细胞24h、48h、3d、5d、7d后,随着HepG2/CDDP耐药细胞株耐药表型的增强,P15表达水平逐渐下降; ⑶成功构建p15正义表达载体;稳定转染细胞后建立P15表达升高的细胞系HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15,空载体对照细胞系HepG2/CDDP-pcDNA3.1及亲本细胞HepG2/CDDP,RT-PCR和Western blot验证转染成功,p15正义表达载体可上调P15的表达; ⑷HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞内阿霉素的蓄积和潴留增高; ⑸HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞增殖指数降低,细胞增殖能力减弱; ⑹HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞的MRP、P-gp蛋白的表达下降; ⑺HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞的Bcl-2表达下降,Bax表达上升。 【结论】 1. HepG2/CDDP动态耐药细胞模型建立成功; 2. P15随着HepG2/CDDP耐药细胞株耐药表型的增强,其表达水平逐渐下降; 3.