方法 1.使用Gateway技术构建人RIP3慢病毒过表达载体。使用酶切连接技术构建RIP3慢病毒十扰载体。 2.携带人RIP3基因的重组HIV-1慢病毒与携带RIP3shRNA序列的慢病毒分别转导野生型U251(U251-WT)细胞株,通过G418筛选转导后的U251,Western blot鉴定RIP3的表达情况。 3.使用AnnexPD98059in V/PI双染法检测U251-WT细胞、U251-RIP3细胞,U251-shRIP3细胞的死亡情况,进一步使用广谱Caspase抑制剂zVAD验证死亡方式。 4.使用CellROXTM Deep Red试剂检测U251-WT细胞、U251-RIP3细胞,U251-shRIP3细胞中ROS的表达水平,研究ROselleck chemicalS在RIP3诱导的细胞死亡中的作用。 5.ELISA法检测上述U251-WT细胞、U251-RIP3细胞,U251-shRIP3细胞中的TNF-a的分泌情况,研究其在RIP3诱导的细胞死亡中的作用。 6.MTT检测上述U251-WT细胞、U251-RIP3细胞,U251-shRIP3细胞的生长情况。 7. WesEpigenetics抑制剂tern blot法检测上述三株细胞中PI3K/Akt信号通路中关键因子Akt的磷酸化情况。 8.MTT法检测上述三株细胞对TMZ的敏感性差异。使用Annexin V/PI双染法检测U251-WT细胞、U251-RIP3细胞在temozolomide作用下的死亡情况。 9. Western blot法检测U251-WT, U251-RIP3, U251-shRIP3中PARP-1的表达情况。