908±0.102mm,在垂直板SDS-PAGE电泳方向上的平均位置偏差为1.032±0.108mm;未处理SGC-7901细胞在IEF方向上的平均偏差为0.838±0.116 mm,在垂直板SDS-PAGE电泳方向上的平均位置偏差为1.075±0.168 mm。表明我们成功地建立了分辨率较高,重复性较好的TGFβ1预处理SGC-790l细胞和未处理SGC-7901细胞的二维凝胶电泳图谱。使用PDquest分析软件对TGFβ1预处理SGC-7901细胞和未处理SGC-7901细胞的各蛋白质点的表达丰度进行分析,我们发现30个差异点,随机选取2个差异点,经原位酶解和MALDI-TOF质谱分析测定它们的PMF,初步鉴定了其中的2个蛋白质点。部分候选的蛋白质差异表达水平经Western
blotting分析可以看出SGC-7901细胞经TGFβ1处理后GST-π,MDR1蛋白表达上调,这些结果与我们蛋白质组学的分析结果是一致的。 4、应用免疫组织化学方法检测TGFβ1、GST-π和MDR1在胃癌组织中的表达情况并分析其与临床病理参数间的关系。结果表明:TGFβ1、GST-π和MDR1的阳性信号主要在细胞浆。在76例胃癌组织中,TGFβ1、GST-π和MDR1的阳性率分别为75%、81.5%及61.8%,且三种蛋白的表达均与分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关(P＜0.05),但与年龄和性别等无关(P＞0.05)。 5、利用Smad4 siRNA、MAPK通路特异性阻断剂处NSGC-7901细胞,然后分别检测GST-π、MDR1的表达水平,以期明确TGFβ1上调GST-π、MDR1表达的信号途径。结果表明:TGFβ1作用SGC-7901细胞后GST-π的表达水平明显上调,但经Smad4 购买Fulvestrant siRNA及PD98059预处理后,其表达水平随之降低;而在SB203580及SP600125处理组GST-π的表达水平无明显变化,提示TGFβ1可能通过经典Smad通路及ERK途径诱导SGC-7901细胞GST-π的表达。而利用外源性TGFβ1处理胃癌细胞SGC-7901,探讨其对SGC-7901细胞MAPK通路的影响时亦发现,SGC-7901的p-ERK表达水平上调,这亦再次表明ERK通路在此分子事件中发挥了重要作用。同时本实验中,我们亦发现TGFβ1作用SGC-7901细胞后MDR1的表达明显上调,但在经SP600125及PD98059预处理后,其表达水平随之降低;而在SB203580及Smad4
点击此处 siRNA处理组MDR1的表达水平无明显变化,这就提示TGFβ1可能通过JNK通路及ERK途径诱导SGC-7901细胞MDR1的表达。而利用外源性TGFβ1处理胃癌细胞SGC-7901,探讨其对SGC-7901细胞MAPK通路的影响时亦发现,SGC-7901的p-ERK、p-JNK表达水平上调,这亦再次表明ERK、JNK通路在此分子事件中发挥了重要作用。 四、结论 1、成功发现TGFβ1可诱导胃癌细胞耐药的发生,其部分机制可能与上调GST-π和MDR1的表达相关; 2、首次发现TGFβ1可分别通过经典Smad通路、ERK途径及JNK、ERK通路上调SGC-7901细胞GST-π和MDR1的表达。
随着社会经济发展和人们生活方式的改变,人类疾病谱正在发生变化,慢性肾脏病(CKD)已呈现流行特征,并成为21世纪全球性的公共卫生问题。CKD一旦发展为终末期肾脏病(ESRD),则必须依赖肾脏替代治疗(RRT),即血液透析、腹膜透析、或肾移植来维持生命,给患者家庭及社会带来沉重的经济负担和社会压力。因此,早期诊断及防治慢性肾脏病有着特殊重要的意义。研究表明,肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS),尤其是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在CKD的发生和进展中发挥重要作用。AngⅡ是RAAS系统最主要的效应分子,业已证实AngⅡ不仅通过改变肾小球血流动力学促进肾小球硬化,还可促进系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞增生、生长因子表达及细胞外基质积聚。AngⅡ的作用是通过与Gq蛋白偶联的Ⅰ型血管紧张素受体(AT1受体)完成的,而AT1受体为跨膜糖蛋白,本身不具有酪氨酸激酶(此酶介导有丝分裂的细胞信号)活性,也不直接与酪氨酸激酶发生联系。本研究将深入探讨AngⅡ介导肾小球系膜细胞增殖及炎症介质的表达的信号转导机制,这不仅有助于加深人们对CKD发病机制的认识,同时也为未来CKD治疗策略的制定提供理论依据。 本研究包括两部分内容: 一、c-Jun氨基末端激酶介导血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞增殖及炎症介质表达 目的:AngⅡ可诱导体外培养的系膜细胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)活化,但其活化后的生物学意义仍不清楚。本研究选用新型的JNK特异性阻断剂SP-600125,探讨JNK-c-Jun/AP-1信号通路在AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞增殖及炎症介质表达中的作用。
一般 方法:体外分离培养人肾小球系膜细胞,应用SP-600125预处理后加入AngⅡ刺激,应用Western Blot检测JNK、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和p38的活性以及c-Jun磷酸化;应用荧光素酶(Luciferase)活性检测法检测c-Jun转录活性及单核细胞趋化蛋白(MCP-1)启动子活性;凝胶电泳迁移率(EMSA)检测活化蛋白-1(AP-1)DNA结合活性;核酸酶保护法检测MCP-1 mRNA表达;ELISA检测培养上清中MCP-1、转化生长因子(TGF-β1)和纤维连接蛋白(FN)的分泌;~3H-胸腺嘧啶(~3H-TdR)掺入法和细胞计数法测定系膜细胞的增殖。 结果:1.AngⅡ可呈时间依赖性和剂量依赖性的方式诱导JNK活化及c-Jun磷酸化,100 nmol/L AngⅡ刺激15 min后,c-Jun磷酸化显著增加,JNK活性明显上调,30分钟达到高峰,是对照组的6.2倍,1 h后几乎恢复到正常水平。 2.JNK特异性抑制剂SP-600125呈剂量依赖性的方式抑制AngⅡ诱导的JNK活化和c-Jun磷酸化,当浓度为10μmol/L和20μmol/L时其抑制作用分别达75%和90%,SP-600125对ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平均无抑制作用。 3.AngⅡ刺激后c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性显著增加,SP-600125可呈剂量依赖的抑制AngⅡ诱导的c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性的增加,20μmol/L SP-600125预处理几乎完全阻断c-Jun的反式激活。4.