2倍,E6使细胞的运动活性增加1.8倍。在集落形成抑制实验中信号蛋白抑制剂PD98059能够完全抑制变异体RON△160介导导的集落形成。 结论: 一.抗-RON单克隆抗体G9和E6对RON受体具有高度的亲和性并且能够与受体的胞外域特异结合而使RON受体及其下游信号蛋白磷酸化;能够显著增加RON△160介导的致瘤活性,包括:诱导细胞形态改变,集落形成及运动活性增加,具有良好的配体模拟样作用,是配体MSP的有效替代者,也是我们研究变异体RON△160致瘤机制的又一有力工具。 二.RON受体酪氨酸激酶及其下游Erk1/2MAPK信号通路可能在RON及其变异体介导的致瘤活性中具有重要作用。
谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质,在神经发育、突触传递、突触可塑性、学习、记忆等一系列脑功能活动中发挥重要作用。而过量谷氨酸可引起NMDA受体的过度活化并诱导神经元死亡,该作用被称为兴奋性神经毒(excitotoxicity)。兴奋毒在许多急慢性疾病中发挥重要作用包括神经退行性疾病、不同原因造成的神经损伤包括缺血/再灌的损伤。根据谷氨酸作用的相对强度和持续时间不同,兴奋毒引起的损伤可能存在坏死或凋亡等不同的细胞死亡形式。坏死性凋亡是新近发现的一种细胞死亡方式,由于兼具坏死及凋亡的特征因此得名,包括出现坏死的形态特征及某些凋亡的信号通路同时伴随自噬的活化。Necrostatin-1(Nec-1)是一种特异且有效的抑制坏死性凋亡的小分子物质,可用来鉴定在神经损伤中是否存在坏死性凋亡的途径。迄今为止,坏死性凋亡的机制并不清楚,Nec-1的发现为评价坏死性凋亡的特征及作用提供了唯一的可能。本研究利用Nec-1作为工具药,通过观察Nec-1对NMDA诱导的兴奋毒的抑制作用,从而明确NMDA诱导的兴奋毒中是否存在坏死性凋亡以及钙超载在其中的作用。实验中通过检测细胞活力、LDH释放及Calcein-AM染色观察NMDA的毒性作用及证实Nec-1的抑制作用,通过激光共聚焦检测NMDA引起的胞内Ca~(2+)升高及Nec-1的作用,证实Ca~(2+)超载在坏死性凋亡的作用。
确认细节 结果显示:1. Nec-1抑制NMDA引起的细胞活力的降低。换句话也就是说Nec-1预处理引起细胞活力的增加,并呈剂量依赖性。Nec-1(30μmol/L)和Nec-1(100μmol/L)分别使其增加12%(p 通常 < 0.05)和26%(p < 0.01),但Nec-1(10μmol/L)并不能抑制NMDA引起的细胞活力的降低。 2. Nec-1抑制NMDA引起的活细胞数的减少。Nec-1(30μmol/L)和Nec-1(100μmol/L)分别使活细胞数增加11%(p < 0.05)和23%(p < 0.01)。 3. Nec-1抑制NMDA引起的LDH释放的增加。Nec-1(30μmol/L)和Nec-1(100μmol/L)分别使LDH释放减少14%(p < 0.05)和28%(p < 0.01)。 4. Nec-1抑制NMDA引起的胞内Ca~(2+)的升高。Nec-1(100μmol/L)使NMDA诱导的胞内Ca~(2+)的升高降低36%(p
< 0.05)。 上述结果表明,除坏死和凋亡外,坏死性凋亡也参与兴奋性神经毒的病理过程。由于NMDA引起兴奋毒在多种损伤中发挥重要作用,因此预防和治疗兴奋毒对预防和治疗神经损伤有至关重要的意义。由于坏死性凋亡具有可调控的特征,因此提供了一个更有意义的预防治疗兴奋性神经毒的靶点。结论:1.坏死性凋亡参与NMDA诱导的兴奋毒;2.胞内Ca~(2+)升高可能是坏死性凋亡发生的机制之一;3.尽管坏死性凋亡在NMDA诱导的兴奋毒中起作用,但其作用可能仅占其中一小部分。
目的建立同步观察行为学和脑电波变化的槐定碱致痫大鼠癫痫模型,观察清醒状态下槐定碱致痫大鼠行为学和脑电波的变化;探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated 并且 protein kinase,MAPK)信号转导通路中的主要成员细胞外信号调节蛋白激酶ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2)通路及其活化形式—磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在槐定碱致痫大鼠海马细胞的表达变化规律及其意义,进而探讨该通路在癫痫发病机制中的作用。 方法①Sprague Dawley大鼠随机分为生理盐水对照组和槐定碱致痫组,通过脑立体定位仪将自制埋藏电极植入大鼠海马一周后,腹腔注射槐定碱(sophoridine,SRI)建立急性化学点燃癫痫大鼠模型,对其行为学和脑电图上的痫性放电进行同步观察。②S D大鼠随机分为生理盐水对照组、槐定碱致痫组、苯巴比妥钠(phenobarbital sodium,PBS)﹢槐定碱组和PD98059﹢槐定碱组,应用免疫组化染色方法检测各组大鼠致痫后0.5h、1.5h、5.0h、8.0h海马CA1区和CA3区ERK1、ERK2和p-ERK1/2的免疫阳性神经元数量的变化和应用Western blot方法进一步检测各组大鼠各时间点海马该三种蛋白表达规律;同时采用HE染色方法和电镜技术观察海马CA1区和CA3区神经元组织病理学和形态学的改变。 结果 1.行为学及大鼠清醒脑电图表现 槐定碱致痫组大鼠腹腔注射槐定碱后,大鼠由活动状态逐渐变得安静,随后出现呆滞,部分动物出现呼吸急促,经8.46±1.62min的潜伏期后,大鼠逐渐出现癫痫样发作表现。开始出现须动、点头、咀嚼样动作,尾巴翘起,湿狗样抖动,伴流涎,至0.5h左右开始有面肌抽动、双前肢抬起阵挛或单肢抽搐,随后出现姿势失衡,跌倒,阵挛抽搐,继之发生全身强直,持续36.84±5.69min,点燃率达100﹪,达到Ⅳ级以上发作的成功率为80%,死亡率为20%。在大鼠痫性发作的同时脑电图出现频发性尖波单棘波,棘波、棘慢波,发作性节律波等癫痫样放电。生理盐水对照组大鼠脑电图均为基础波,且无癫痫样放电。槐定碱致痫大鼠癫痫发作过程中伴有与行为相一致的清醒脑电图改变。 2.