5倍和1.25倍。应用特异性阻断剂后,钛颗粒诱导的磷酸化p38蛋白水平升高和MMP-2
mRNA水平升高的效应完全被抑制。 结论钛颗粒通过p38丝裂原活化蛋白激酶信号在转录水平诱导成骨细胞MMP-2表达增多。
研究目的： 硼替佐米(万珂,Bortezomib/velcade)是一种二肽硼酸衍生物,是第一个由美国食品药物管理局(FDA)批准上市的蛋白酶体抑制剂,对多发性骨髓瘤的治疗具有较高的总体有效率和完全缓解率。Bortezomib抗瘤谱广,研究表明Bortezomib能诱导急性髓性白血病细胞(AML)发生凋亡,且单药或联合其他化疗药物治疗白血病均具有一定的临床疗效,但其作用机制阐释尚不明确。随着对细胞分化异常在恶性肿瘤发病学和治疗学上的意义认识的日益加深,肿瘤的分化治疗成为当今肿瘤学研究的热点之一。其中,全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒白血病(M3, Ivacaftor细胞系 APL)疗法,已列为诱导缓解APL的首选方案之一,但ATRA耐药、严重毒副反应以及复发等仍是当前迫切需要解决的问题。因此,寻找高效低毒的新型分化诱导剂或寻找有效的药物联用方案是解决上述问题的关键途径。 基于此,本研究探讨了Bortezomib单药或联合ATRA在诱导分化治疗AML中的药效及其作用机制。研究内容主要包含了两个部分：(1) Bortezomib对急性髓性白血病细胞的诱导分化作用及其作用机制研究；(2) Bortezomib联合ATRA对急性髓性白血病的协同治疗作用,并探究了维甲酸受体RARα通路在该过程中所发挥的作用。 研究方法： 1)选用人白血病细胞株HL60和U937为主要研究对象,人原代急性髓性白血病细胞为辅助研究对象,考察了Bortezomib对AML细胞的分化诱导作用：采用台盼蓝染色结合血细胞计数板计数观察细胞增殖情况,描绘细胞增殖曲线；应用吉姆萨染色观察细胞形态学改变；采用硝基四氮唑蓝(NBT)测试细胞还原能力；细胞经CD14-FITC或CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD14或CD11b表达；应用Western blotting检测MAPK家族蛋白表达及活化水平(p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-p38、MEK、JNK2、p38),检测分化启动因子STAT1表达及活性水平(p-STAT1 Try701、STAT1);应用Realtime PCR检测细胞STAT1 mRNA表达水平,并利用CHX抑制蛋白合成研究Bortezomib引起的STAT1蛋白上调的原因；用携带shRNA-STAT1的慢病毒载体转染HL60细胞,通过沉默STAT1研究其在Bortezomib诱导的AML细胞分化中的关系。利用MEK特异性抑制剂PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580研究MAPK通路在Bortezomib诱导的AML细胞分化中的关系；采用Annexin Proteasome 抑制剂 V-FITC/PI染色结合流式细胞术测定Bortezomib对AML细胞的凋亡率及初步探讨Bortezomib诱导的细胞分化与凋亡的关系。
2)选用人白血病细胞株HL60和NB4为主要研究对象,人原代急性髓性白血病细胞为辅助研究对象,考察Bortezomib与ATRA对AML细胞的联合治疗作用：采用台盼蓝染色结合血细胞计数板计数观察细胞增殖情况和细胞存活率,描绘细胞增殖曲线；应用吉姆萨染色观察细胞形态学改变；采用硝基四氮唑蓝(NBT)测试细胞还原能力；细胞经CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达；采用HL60细胞裸小鼠移植瘤模型考察Bortezomib与ATRA在体内的联合治疗作用；采用免疫组化法检测瘤组织切片C/EBPε的蛋白表达含量；采用TUNEL法考察瘤组织切片中凋亡情况；应用Western blotting检测RARα蛋白表达情况,检测相关分化转录因子的表达(p-STAT1 Try701、STAT1、c-Myc、C/EBPε、p-27),检测MAPK家族蛋白表达情况(p-MEK、p-JNK);应用Realtime PCR检测细胞RARα、STAT1 mRNA表达水平；采用免疫荧光法检测p65和STAT1在细胞内的定位；采用非放射性凝胶迁移法检测STAT1与DNA的结合能力；用慢病毒介导的STAT1 shRNA转染HL60细胞,通过沉默STAT1研究其在Bortezomib与ATRA联用治疗AML中的作用。
研究结果： 第一部分：Bortezomib通过上调MEK/ERK-JNK p46通路活性,激活STAT1从而诱导AML细胞向单核/巨噬系细胞分化。 1) Bortezomib具有诱导人急性髓性白血病细胞向单核/巨噬系细胞分化成熟的能力。 用细胞增殖抑制率、细胞形态学、生化指标、分子标志等指标观察Bortezomib对AML细胞的诱导分化成熟能力。结果显示Bortezomib (5 nM)能诱导人急性髓性白血病(AML)细胞向单核／巨噬系细胞分化。Bortezomib (5 nM)可显著抑制HL60和U937细胞增殖,第3天的抑制率分别为44.6%和60.6%。吉姆萨染色结果表明Bortezomib (5 nM)作用72小时后,HL60细胞和U937细胞分化成为幼稚单核细胞或成熟单核细胞,形态学上表现为胞体变小,核／浆比例下降,细胞核固缩,部分呈半月核,细胞中核仁减少或消失。Bortezomib作用后的HL60和U937对NBT的还原能力增强,并呈现剂量依赖性关系。同时Bortezomib诱导的分化抗原CD11b/CD14的表达也呈现剂量依赖性和时间依赖性关系。 {TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂| 购买TNF-alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂半抑制浓度|TNF-alpha抑制剂 价格|TNF-alpha抑制剂 花费|TNF-alpha抑制剂溶解度|TNF-alpha抑制剂购买|TNF-alpha抑制剂制造商|TNF-alpha抑制剂研究购买|TNF-alpha抑制剂订单|TNF-alpha抑制剂小白鼠|TNF-alpha抑制剂化学结构|TNF-alpha抑制剂分子量|TNF-alpha抑制剂分子重量|TNF-alpha抑制剂数据表|TNF-alpha抑制剂供应商|TNF-alpha抑制剂体外|TNF-alpha抑制剂细胞系|TNF-alpha抑制剂浓度|TNF-alpha抑制剂核磁共振|TNF-alpha抑制剂体内|TNF-alpha抑制剂临床试验|TNF-alpha抑制剂s|TNF-alpha signaling抑制剂|TNF-alpha pathway抑制剂|TNF-alpha signaling pathway抑制剂|TNF-alpha signaling抑制剂s|TNF alpha pathway抑制剂s|TNF-alpha signaling pathway抑制剂s|TNF-alpha抑制剂 library|TNF-alpha activity inhibition|TNF-alpha activity|TNF-alpha inhibition|TNF-alpha抑制剂s library|TNF alpha抑制剂 libraries|TNF-alpha抑制剂 screening library|TNF-alpha high throughput screening|TNF-alpha抑制剂s high throughput screening|TNF-alpha phosphorylation|TNF-alpha screening|TNF-alpha assay|TNF-alpha animal study| 此外,Bortezomib对人原代急性髓性白血病细胞(M3-AML, APL)增殖也有显著的抑制作用,吉姆萨染色表明Bortezomib具有诱导人原代急性髓性白血病细胞成熟分化的能力。 2) Bortezomib诱导AML细胞分化成熟的机制研究 Western blotting检测结果显示,Bortezomib能激活MAPK通路(包括MEK/ERK级联反应、JNK p46通路和p38通路),p-MEK、p-ERK、p-JNK p46、p-p38均呈现上调趋势,并呈现时间依赖性关系,而其相应的原型蛋白表达水平不变。当给予MEK特异性抑制剂PD98059或JNK特异性抑制剂SP600125时,Bortezomib引起的MEK、ERK或JNK p46的活化被抑制,同时CDl4和CD11b的表达分别从Bortezomib单药组的27.3%和35.8%下降到对照组水平。此外,PD98059同时抑制了Bortezomib引起的JNK p46的活化,但SP600125对MEK活性无影响。当给与p38特异性抑制剂SB203580时,Bortezomib诱导的CD14和CD11B的表达率为42.6%和56.